蛋白质谱的原理及使用（一）

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为了直观一些，我们先上几张质谱仪的照片，大伙儿感受一下~

质谱仪到底是个啥呢？我们还是先来掉个书袋吧，“官方”定义是这样的：用来测定气态离子质荷比（m/z）的仪器。对照的英文是：An instrument used to determine the mass-to-charge ratio (m/z) of gas phase ions

我们来抓抓这里面的关键词：气态、离子、质荷比！

从这几个关键词里，你感受到了吗？其实质谱仪检测的范围是非常有限的。首先，它只能检测气态的物质，其次，该物质还必须得是离子。而检测得到的数值也只是该离子的质量与电荷的比值！ 也就是说，当离子带一个正电荷或一个负电荷时，质谱仪检测到的m/z的数值就刚好等于离子的重量；当电荷数大于等于2时，我们得用检测到的m/z的数值乘以电荷数，才能得到离子的质量。

看到这里，你是不是有点感慨，原来大名鼎鼎的质谱仪，也就这点儿功能啊~我要说的是，功能不在多，而在专！就是这点功能，却引领了整个领域的革新！

质谱仪的离子的质荷比测定到，可以通过质谱图展示。那么质谱图又是长什么样的呢？

我们以上面两张质谱图为示例，质谱图的横轴就是质荷比，纵轴是离子强度。第一张是正丁烷的谱图，横轴质荷比的取值范围是从10到60。另一张是代谢物质谱图，横轴质荷比是100-400。那些小柱子就是信号峰了。

接下来，我们要聊的问题就是：质谱仪是如何获得这些质谱图？

前面说了，质谱只能检测离子，所以要得到质谱图，首先我们要获得离子。离子分为两类：正离子和负离子，那么对应的，它们带正电荷或者带负电荷。

要生成一个正离子，其实就是分子结合一个或多个质子，就可以带上正电荷，这是最简单直接的办法；或者呢，让一个分子失去一个电子，也可以带上一个正电荷。相应的，生成负离子的方法，就是分子结合一个电子，或者失去一个质子。

我们还是以正丁烷为例，它的分子量是58，我们在质谱图的横轴（m/z）58处正好看到一个峰，说明是正丁烷的质谱图是正丁烷分子失去一个电子后，生成正离子而得到的。

我们再来看看另外一个例子，比如一个分子式为C22H25O3N3的化合物，通过计算知道它的分子量是3791890，而在质谱图我们看到m/z轴上的峰是在3801958，实际上是这个化合物得到一个质子后（分子量+1），形成正离子产生的质谱图。

所以呢，不同的质谱仪，不同的化合物，会得到不同的质谱图。比如第二个例子，如果你以为它的分子量就是3801958，那计算出的结果肯定就是错的了。

那么，质谱仪是如何得到不同离子的质荷比信息呢？要回答这个问题，我们可以从质谱仪的种类和工作原理聊起。

磁质谱仪

前面说了，质谱仪是测定气态离子质荷比的仪器，所以进入质谱的离子一定得是带电的。当带电的离子进入电场或磁场时，它的飞行轨迹遵循一定的规律。比如我们把离子放到一个磁场当中，它飞行的时候会产生一个偏转，而偏转的半径与离子质荷比、磁场强度，以及它的动能有关，这就是洛伦兹力。通过检测它的偏转程度，就可以计算出它的质荷比。

所以最简单的质谱仪就是这种磁质谱仪，让离子飞过一个磁场，通过检测器检测它转弯的半径，就可以计算出它的质荷比。当然，现在这类质谱仪用得比较少了。接下来我们要介绍的TOF质谱仪更常用。

飞行时间质谱仪（TOF）

这是目前很常用的质谱仪类型。它的工作原理是这样的，通过离子源得到离子以后，离子经过一个加速的区域，所有的离子都会获得一个相同的初始动能，然后它们进入一个没有电场的区域，进行自由地飞行！是不是画图很美？由于所有离子的初始动能是相同的，那么重的离子飞行速度就会慢一些，轻的离子飞得快一些，最终离子都会通过整个飞行区域，到达检测器。

通过测量离子的飞行时间，我们就可以推算出离子的质荷比。飞行时间是与质荷比的平方根成正比的。这就有点像跑步比赛，重的离子跑得慢一些，轻的跑得快一些，我们拿一个秒表，通过测定跑步时间，就可以计算出每个离子的质荷比了。这是一种原理很简单的质谱仪，也是目前使用广泛且性能很不错的质谱仪。

TOF质谱仪长什么样呢？我们来看看下面两个图。

这就是典型的飞行时间质谱仪的模样。因为我们要让离子在一个跑道上飞，就像奥运会上的跑步比赛一样，如果离子们都来跑100米，第一名和第二名可能只差001秒，区别起来会比较困难。但如果跑3000米，第一名与第二名可能会差10秒，甚至更多。所以跑道越长，我们越容易把离子区分开来。所以飞行时间质谱仪通常都需要有一个很长的飞行区间。

上图是两种典型的TOF质谱仪，左边是AB的4700质谱仪，它是竖着跑的，所以很高，有两米多。右边是Bruker的Ultraflex质谱仪，是横着跑的，长度也有两米多。所以TOF质谱仪的外表特点就是非常长，为了让离子能够尽可能跑得远一些。

四级杆质谱仪

除了TOF，还有一类很常用的质谱仪，就是我们经常听到的四级杆质谱仪。

为啥叫这个名字呢？如果我们来观察一下它的横截面，会发现，它是由四根电极组成的，电极的截面并不是完美的圆，而是双曲抛物线。

在横截面上，四根电极分成两组，两个相对的是一组，在相对的电极上加上一个相同的交流电压和直流电压，而在相邻的电极上，则加上相反的交流电压和直流电压，通过叠加交流电压和直流电压，不同质荷比的离子进入四级杆以后，会发生震荡，一边飞行，一边转圈。

当扫描的电压和频率一定的时候，只有特定质荷比的离子才能穿过四级杆，到达检测器。而其它质荷比的离子就会因为偏转太多，而打到四级杆上，或者从缝隙里穿出。

所以，四级杆质谱仪是用来做质量选择，只让特定质荷比的离子穿过质谱仪。通过改变四级杆上的电压，我们就可以让不同质荷比的离子依次穿过质谱仪，到达检测器。

四级杆质谱仪的外观通常都不会很长，在15-30cm左右，结构是比较紧凑。

离子阱质谱仪

还有一类质谱仪，与四级杆质谱仪非常相似，它就是离子阱质谱仪。分为两类，一类叫三维离子阱（3D Ion Trap）质谱仪，另一类叫线性离子阱（Linear Ion Trap）。

线性离子阱与四级杆质谱仪长得是非常像的，它的横截图跟四级杆质谱仪是一样的，只是它的侧面开了一个洞，来作离子弹出用的。四级杆质谱仪中，离子是穿过质谱仪飞出去的，而在离子阱质谱仪中，离子不会飞出质谱仪，而是一直在阱里面，沿着右下图像8字型的轨迹飞行。当扫描电压达到一定的数值以后，离子会被射出来。

离子的飞行轨迹示意图

对于三维离子阱，我们可以理解为，是将线性离子阱无限地压缩，压缩到最后变成这样一个很短的圆环，形成一个陷阱结构。三维离子阱有两个端电极和一对环形电极构成了一个封闭的空间，把离子困在里面。离子“阱”的名字就是这么来的，相当于是一个陷阱，把离子包在里面，一直进行转圈的运动。

离子阱与四级杆一样，可以通过改变加到离子阱上的扫描电压，让不同质荷比的离子射出来进行检测，也可以将特定质荷比的离子留在离子阱里面，进行后续的处理和操作。这是它们与TOF最大的不同，TOF只能检测不同质荷比的离子，却不能选择让哪些离子留下，而四级杆和离子阱既可以检测离子，同时也可以实现离子的选择，将想要的离子留在离子阱中，或者说，让特定的离子穿过四级杆。所以四级杆或离子阱还有一个名称，叫质量过滤器，它可以过滤特定质荷比的离子。

FTICR和Orbitrap

我们要聊的第四类质谱仪是FTICR和Orbitrap，这类质谱是基于离子在电场或者磁场中会作回旋运动，通过测定回旋共振频率，并进行傅里叶变换，从而测定离子质荷比。

我们先来看看FTICR（见下图），它是将离子放到一个高强度的磁场中进行自旋共振，所以需要一个很大的超导磁铁，用来产生一个很强的磁场。

而Orbitrap则克服了必须要使用超导磁场的困难，它使用一个电场来限制离子的自旋共振。

image

这种类似的质谱仪都有非常高的分辨率，当然价格也很高。

以上就是我们常用的四类质谱仪：磁质谱仪、TOF、四级杆&离子阱、Orbitrap&FTICR，根据它们的原理和作用的不同，可以分为两大类：

1 质量检测器：仅可测定进入质谱仪的不同质荷比离子的丰度（TOF和Orbitrap等），不能选择离子通过质谱仪；

2 质量过滤器：测定不同质荷比离子的丰度，让特定质荷比或质荷比区段的离子通过质谱仪（四级杆和离子阱）。

《中国化学会首届全国质谱分析学术研讨会会议论文集》2014年

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四极离子阱中离子碰撞模型研究

贺木易  郭丹  徐伟  

摘要：离子阱中运动的离子与中性载气分子碰撞并发生能量交换,导致离子"冷却",即离子运动振幅衰减。此衰减过程的检测与分析对获得样品性质至关重要,如离子质量、离子反应截面积等,基于此原理的检测技术广泛应用于FT-ICR等仪器[1]中。目前,研究离子碰撞机制的理论主要有Langevin碰撞模型[2]、硬球碰撞模型[3]等,均存在一定的局限性。本工作介绍了一种基于四极离子阱的混合碰撞模型,有效结合了Langevin碰撞模型与硬球碰撞模型的理论特点,使此模型能合理准确的描述离子阱中离子衰减过程。研究采用平均法对求解了Langevin碰撞模型、硬球碰撞模型、混合碰撞模型的运动微分方程,获得了三种模型的理论离子衰减轨迹。通过轨迹比较,可获得不同模型对离子衰减过程的影响。为验证混合模型合理性,进行了基于Matlab的离子轨迹仿真实验,并对仿真数据进行了理论曲线拟合。仿真条件如下:频率为]MHz的RF射频电压施加于几何尺寸5×5mm线性离子阱上,真空度1 mTorr,缓冲载气为氦气,样品为血管紧张素II(离子尺寸r0=0883nm、质荷比m/z=523),离子初始位置距离子阱中心4mm,仿真时间100ms,q值为03。初步结果如下:在衰减初期(53ms之前),离子发生的碰撞主要为硬球碰撞,之后的衰减则由Langevin碰撞主导,即处在离子阱不同位置的离子由于具有不同能量而发生不同碰撞,高能量离子易发生硬球碰撞,反之易发生Langevin碰撞。传统模型无法描述此衰减的全过程,而混合模型较为合理的体现了不同模型间的变化,离子轨迹仿真实验验证了这一结论(如图)。分别用Langevin、硬球、混合理论模型对仿真结果进行拟合,R~2分别为07447、0988l、09912,即混合模型最好的描述了仿真结果。另一方面,样品离子的性质也会影响其衰减过程,质量数高、半径较大的样品离子由硬球碰撞主导其衰减过程,反之由Langevin碰撞主导。载气种类、温度、真空度、离子阱尺寸等因素亦对离子碰撞模型起不同程度的影响。以上结果表明,混合模型可较为合理的表现单一模型无法描述离子的衰减过程。通过混合模型衰减过程分析,可获得样品的质量及尺寸信息,有助提高离子阱质谱方法的检测效果。

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