高中生物相应物质都被染色的染成什么颜色

1、菲林试剂 还原糖 砖红色沉淀（需水域）

2、苏丹三 脂肪 橙红

3、苏丹四 脂肪 红

4、双缩脲 蛋白质 紫

5、龙胆紫 染色质 紫

6、碘 淀粉 蓝

7、健那绿 线粒体 绿

8、甲基绿 DNA 绿

9、吡罗红 RNA 红

10、溴麝香草酚蓝 CO2 由蓝变绿再变黄

11、重铬酸钾 酒精 酸性条件下由橙色变成灰绿

12、醋酸洋红（龙胆紫、改良苯酚品红） 染色质 红

13、台盼蓝 检验活死细胞 死细胞会被染成蓝色（不常用）

A、细胞死亡后，台盼蓝进入细胞内，导致细胞被染色，A错误；

B、用台盼蓝染色，台盼蓝为细胞不需要的物质，活细胞不吸收，死细胞膜失去了活性，丧失控制物质进出细胞的功能，台盼蓝进入细胞，细胞才会被染成蓝色，B正确；

C、死亡细胞的细胞膜失去了选择透过性，才导致细胞被染色，C错误；

D、鉴别鉴别细胞死活的方法还有细胞的质壁分离复原，观察细胞质的流动方向等，D错误．

故选：B．

染色原理

正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。

台盼蓝拒染法

台盼蓝拒染法是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不能被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。

中文名

台盼蓝拒染法

染色原理

正常细胞具有完整的细胞膜结构，而死亡的细胞其细胞膜结构被破坏。台盼蓝无法通过正常的细胞膜因而正常的细胞不被台盼蓝染上，而死细胞则可被台盼蓝染成蓝色。

流程

（1）将对数生长期的细胞浓度调整为1~10×10细胞/ml，按10~10个细胞接种于96孔板，每孔100 μl；

（2）培养细胞24小时后，对其进行不同处理，每个处理设三个平行对照；

（3）收集细胞，经台盼蓝染色，在倒置显微镜下计数蓝染及不染色细胞，计算细胞存活率；

（4）结果统计：

镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。

根据下式求细胞活力：

活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100

注意事项

台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

中性粒细胞(PMN)是机体防御系统的主要组成部分，能吞噬和杀灭多种致病原。致病原与血清中的特异性抗体(IgG)结合后,通过IgG的Fc部分与PMN表面的受体——FcγRⅢ(CD16b)相结合，从而被吞噬。FcγRⅢ有a、b两种类型，FcγRⅢa(CD16a)是一种跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一种糖肌醇磷脂蛋白(GPI-锚蛋白)［1］。近年发现阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者在血细胞表面缺失各种特异的GPI-锚蛋白，CD16b正是这类蛋白之一。为探讨PMN表面CD16b的缺失与PMN释放氧自由基杀菌功能的关系，将我们的研究报告如下。

材料和方法

1　标本采集　正常人外周血取自协和医院血库正常献血者，正常骨髓取自协和医院胸外科手术患者的肋骨，PNH患者按1987年全国溶血性贫血会议拟定的诊断标准，并经流式细胞仪免疫荧光法检测CD59标记率进一步确诊。

2　中性粒细胞的分离　 新鲜的外周血或骨髓，用肝素抗凝，经淋巴细胞分离液分离，去除淋巴细胞和单个核细胞，用右旋糖酐(dextran，分子量=7～11 万) 沉降和低渗法去除红细胞，得到纯净的中性粒细胞。用台盼蓝染色法检查细胞活力，须保证细胞存活率大于95%。

3　间接免疫荧光法检测CD16　取1×106个细胞，悬浮于100μl 2% BSA中，室温封闭30分钟，加 CD16单克隆抗体(Immunotech SA公司产品)，在室温作用30分钟后，用PBS洗涤2次，再悬浮于100μl 2％BSA中，加FITC 标记的羊抗鼠IgG(Gibco公司产品)室温暗染20分钟后洗去二抗。用500μl PBS悬浮细胞，用流式细胞仪检测CD16 标记率。

4　中性粒细胞功能测定　 佛波醇酯(PMA，Sigma产品，用DMSO溶解，配制成1mg/ml，储存于－20℃，临用前稀释)能激活中性粒细胞，使之释放活性氧，其中O-2和H2O2能与化学发光剂Luminol(3-氨基苯二甲酰肼，北京化工厂)反应而发光。用LKB-1250发光仪(Luminometer)检测。正常人和PNH患者中性粒细胞，制备成细胞悬液(107 /ml)与 100nmol/L PMA 反应，37℃15分钟,置于冰上终止反应，取含1×105 细胞的激活液加入到1ml 01nmol/L 的Luminol 溶液中，立即测定发光值，每一数值测定3次以上， 取平均值。取正常人的不同细胞数，测定发光值，结果显示发光值与细胞数有良好的线性关系，说明此方法具有可靠性 (附图)。

附图　细胞数与发光值的线性关系

5　细胞培养　以 1×106个细胞/ml的密度接种PMN于IMDM培养基(含10%自身血清)，37℃、5% CO2分别培养12，16，20小时。

6　细胞形态学观察　不同培养时间的细胞用瑞氏染色，光学显微镜下观察。

7　DNA含量分析　取细胞1×106，PBS洗2遍，以70%冷乙醇(4℃)固定12小时以上，用PBS洗去乙醇，加入05ml柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 78)室温作用5分钟，离心后以PBS重悬细胞，加入 RNaseA (终浓度60μg/ml)37℃作用30分钟，再加入碘化乙锭(PI，终浓度50μg/ml)4℃暗染30分钟，以染细胞内总DNA，用流式细胞仪分析正常细胞和凋亡细胞，计算凋亡率。

结　　果

1　形态学观察　新鲜外周血分离出的中性粒细胞有典型的分叶核，经培养后，形态出现一系列凋亡细胞特性的形态学改变。培养12小时，细胞体积变小，胞浆浓缩，核浓缩；培养16小时以后，部分细胞聚集成团，细胞核碎裂成小块，胞浆中出现空泡，凋亡小体形成。培养时间越长，光镜下可见的凋亡细胞比率越高。

2　中性粒细胞培养过程中CD16的标记率随时间的延长逐渐降低，而凋亡率逐渐增加，中性粒细胞的功能则呈明显的下降趋势，结果见表1。

表1　体外培养不同时间的正常外周血中性粒细胞的几项指标比较

培养时间

(小时) CD16标率

(%) 流式仪检测

凋亡率(%) 发光频率

(次/分)

0 995 12 12432

12 644 295 6727

16 300 394 4543

20 181 640 3018

3　PNH患者的PMN释放超氧功能与正常人相比有显著的差异，结果见表2。

表2　PNH患者骨髓与正常骨髓中性粒细胞几项指标的比较

组别 例

数 CD59标记率

(%) CD16标记率

(%) 发光频率

(次/分)

正常组 10 ＞9500 ＞9500 11716±1147

PNH组 5 1360±426 244±098 4482±1652

P值 ＜0001 ＜ 0001 ＜ 0001

讨　　 论

　　Ravetch等［1］报告CD16有变异型分布在不同细胞。CD16a分布在巨噬细胞和NK细胞表面，是跨膜蛋白；CD16b仅存于PMN，是GPI锚蛋白。我们应用CD16单抗检测CD16b在PMN表面的量。

　　PMN的杀菌功能涉及许多方面，有氧化型和非氧化型因素。本实验用不依赖于Fc受体的激活剂PMA来激活PMN，应用发光法测定氧自由基，包括O-2、H2O2及OH-，测定时，加入PMN激活液即刻连续记录1分钟，以发光最高值计算，代表PMN受刺激后的即刻反应，反映释放氧自由基的能力，氧化型杀菌的功能。

　　PNH是造血干细胞PIG-A基因突变引起的克隆病，不同患者的异常血细胞GPI-锚蛋白缺失情况有很大差异，Schubert等［2］报道，PNH患者CD16缺失较CD59更明显，我们也观察到这个现象(结果见表2)，而且发现骨髓中PMN CD16b阴性细胞比外周血多，因此选择了PNH患者骨髓的PMN作为研究对象，并且我们所选择的都是病情较严重，病态细胞率高的病例(以CD59的标记率为标准)，因此结果更具有可靠性。

　　从以上结果得知CD16b表达量低的PNH患者，PMN释放氧的能力亦低，两者有平行的关系。为了进一步证实它们的相关性，应用正常人PMN在体外培养，也获得同样的结果。在培养过程中CD16b逐渐减少，释放氧自由基的功能也降低，两者有相伴关系。Hunizinga等［3］也曾发现在PMN激活的同时有CD16b的丢失。

　　根据Dransfield等［4］的报道，随CD16b表达量的下降，PMN逐渐凋亡。所以在PMN体外培养的同时又观察了其凋亡的情况。从形态及DNA含量变化，证实在CD16b表达量降低，释放氧自由基功能降低的同时，细胞出现凋亡，凋亡程度与其两项指标降低程度同步。

　　总之，正常人PMN在凋亡过程中CD16b减少的同时，释放氧自由基的功能也降低；PNH患者CD16b减少，释放氧自由基也减少，至于两者之间有何内在关联，有待进一步研究。但至少从另一个侧面说明PNH患者PMN表面CD16b缺失，使受体介导的特异性识别吞噬病原菌的功能下降；释放活性氧减少以致氧化杀菌功能降低，这两方面可能是PNH患者易受感染的原因。

参 考 文 献

1　Ravetch,JV,Perussia BAlternative membrane forms of FcγRⅢ (CD16)on human natural killer cells and neutrophilsJ Exp Med,1989,170:481-497

2　Schubert J,Alvarado M,Ucicechowski P,et alDiagnosis of PNH using immunophenotyping of peripheral blood cellsBr J Haematol,1991,79:487-492

3　Hunizinga TWJ, van der Schoot CE,Jost C,et alThe PI-linked FcγRⅢ is released on stimulation of neutrophilsNature,1988,333:667-669

4　Dransfield I,Buckle AM,Savill JS,et alNeutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD16(FcγRⅢ) expressionJ Immunol,1994,152:1254-1263

在用血球计数板计算酵母菌数量时用到了。因为，只有死细胞才会被台盼蓝染色，所以计数只记没有被染色的。

原因：活细胞因为细胞的选择透过性会对台盼蓝有排斥作用，不会被染色，而死细胞没有选择透过性，会被染色。

一 台盼蓝配制：4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加09%NaCl至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。或者直接用09%的生理盐水或者PBS配成母液 用的时候用生理盐水或者PBS稀释 。

台盼蓝染色步骤：

1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至04%。（也可买Gibco的成品）; T　

2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。

3、染色：细胞悬液与04%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度004%）　

4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。　

5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。　

6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%

二 结晶紫配制：

结晶紫 20g

草酸铵 08g

95％酒精 20ml

馏水 80ml

先将结晶紫溶于酒精，草酸铵溶于蒸馏水中，然后将两液混合，静置48小时使用。此染液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。

结晶紫染色步骤：

1．在96孔细胞培养板各孔中加01ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5％ CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。

　　2．用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加01ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加01ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。

　　3．甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加01ml 10％甲醇溶液固定细胞30秒钟。

　　4．吸去甲醇溶液，每孔加01ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。

　　5．轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。

　　6．测定前，每孔加01ml 33％醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性

1、龙胆紫，又名甲紫、结晶紫

甲紫属于三苯甲烷类染料消毒剂，和微生物酶系统发生氢离子的竞争性对抗，使酶成为无活性的氧化状态，从而发挥杀菌作用。主要对革兰氏阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及绿脓杆菌、白念珠菌、表皮癣菌有杀灭作用，对其他革兰氏阴性菌和抗酸菌几乎无作用。

2、醋酸洋红

在涂抹法与压碎法中，醋酸洋红常被用作核、染色体的固定和染色剂。在煮沸的45%醋酸中加洋红使之饱和，再加入微量的铁离子，便使醋酸洋红材料在为醋酸固定的同时，洋红将核或染色体染成红色。PH呈酸性。

3、斐林试剂

二价铜离子的酒石酸钾钠配合物，可以被脂肪醛或还原性糖还原为氧化亚铜。斐林试剂为深蓝色溶液， 在与脂肪醛或还原性糖共热时， 蓝色消失，析出红色的氧化亚铜沉淀。在氧化亚铜析出过程中， 反应液的颜色可能经过由蓝色→绿色→**→红色沉淀的逐渐变化，反应较快时，直接观察到红色沉淀。

它与可溶性的还原性糖（葡萄糖、果糖和麦芽糖）在加热的条件下，能够生成砖红色的氧化亚铜沉淀。因此，斐林试剂常用于鉴定可溶性的还原性糖的存在与否。

4、班氏试剂

本尼迪特试剂，也称班氏试剂、本尼迪克试剂、本尼迪克试液或班乃德试剂，是一种浅蓝色化学试剂。本尼迪特试剂是斐林试剂的改良试剂，它与醛或醛糖反应生成红**沉淀。它是由硫酸铜、柠檬酸钠和无水碳酸钠配置成的蓝色溶液，可以存放备用，避免斐林溶液必须现配现用的缺点。

5、酚酞

酚酞是一种常用酸碱指示剂，广泛应用于酸碱滴定过程中。通常情况下酚酞遇酸溶液不变色，遇中性溶液也不变色，遇碱溶液变红色。

6、溴麝香草酚蓝

溴麝香草酚蓝（Bromothymol Blue），又名溴百里香酚蓝。英文简称BTB。溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂、吸附指示剂。 在生物学实验中常用作水生生物的呼吸试剂。

-甲紫

-醋酸洋红

-斐林试剂

-本尼迪克特试剂

-酚酞试液

-溴麝香草酚蓝