端粒酶抑制剂的作用机制是什么？

1，端粒酶作为一种负责延长端粒的核蛋白逆转录酶，对于细胞染色体的稳 定性和细胞活性的维持有重要作用，端粒酶的活性在正常组织中被抑制，而在恶性肿瘤细胞中其阳性率可达 84% ～95%，人体绝大部分恶性肿瘤的发生发展过程与端粒酶活性有非常紧密的联系，针对这一现象，并结合端粒酶本身的特点， 人们开发出端粒酶抑制剂，应用不同端粒酶抑制剂针对端粒酶的不同组分及作用 途径进行破坏或阻断，从而抑制端粒酶活性最终限制肿瘤的生长及发展，这是近年来国内外学者积极探索的一个方向。

2，端粒酶全酶复合物有很多可以做抑制剂的靶点, 包括hTR(端粒酶RNA 成分)、hTERT( 端粒酶逆转录催化亚单位) 和引物锚定位点等。

① 以端粒酶催化亚基为抑制位点：显性失活hTERT(由于突变造成催化功能丧失但仍能与染色体和hTR 结合的突变体) 在体内与体外都可以有效抑制端粒酶活力。显性失活hTERT 的导入能有效地抑制一些癌细胞的端粒酶活性, 并且使端粒变短。

②．逆转录酶抑制剂( RTI )：逆转录酶抑制剂( RTI) 是最早用于治疗HIV的药物。端粒酶是一种依赖RNA 的DNA 聚合酶,RTI 能参入端粒DNA 中通过逆转录酶阻断DNA链的延伸。AZT( 3′- 叠氮脱氧胸苷) 是研究最广泛的RTI, 其在DNA 复制时可以参入链中而使复制终止。研究发现, AZT 在体外有抑制肿瘤细胞增殖的作用; 对体外培养的肝癌细胞、大肠癌细胞及肺癌细胞都有作用, 但存在敏感性差异。同时, AZT 降低端粒酶活性达50%左右, 并可使HeLa 细胞的端粒发生不可逆变的缩短。AZT、ddG( 2′,3′- 双脱氧鸟苷) 这些逆转录酶抑制剂可能是通过优先占据端粒酶的核苷酸结合位点而抑制了端粒合成。

③．小分子抑制剂：一些小分子化合物也可以抑制端粒酶活性。硝基苯乙烯的衍生物3,5- 二氯苯氧硝基苯烯(DPNS)能抑制癌细胞中端粒酶的活性。喹喔啉的衍生物2,3,7- 三氯- 5- 硝基喹喔啉(TNQX)是人端粒酶的非竞争性抑制剂,其结合位点不同于TS 引物和dNTP 的结合位点,TNQX 有望成为抗肿瘤药物。使用NCI -COMPARE分析或其他大规模筛选模型来发现候选的端粒酶抑制剂是一个新兴领域。NCI-COMPARE用生物信息学综合了药物检测和分类的策略, 依靠已知化合物的相关化学结构, 得到了一些rhodacyanine衍生物。这些分子的作用机制不清楚,但可以阻断端粒酶锚定于端粒上, 阻断端粒酶全酶合成, 用这些小分子筛选方法, 可能会产生一些新类型的端粒酶抑制剂。

生命之源——端粒酶因子

1）什么是端粒？

端粒是染色体末端的一种特殊结构，它是由许多简单的重复序列和端粒结合蛋白组成。在正常人体细胞中，端粒随着细胞的不断分裂而逐渐缩短。端粒是细胞必需的遗传成分，其作用是保护和补偿染色体末端遗传信息的丢失，保护它不会被核酸酶识别而免遭降解。但是，在细胞不断复制的过程中，端粒也会因为复制机制的欠缺或者其他多种原因而缓慢地丢失。研究表明，年纪越大，细胞越老，其端粒的长度也越短；细胞越年轻，端粒的长度也越长，端粒与细胞老化有确定的关系。当细胞端粒缩短时细胞端粒功能受损，细胞端粒的功能受损时，细胞就出现衰老现象；而当细胞端粒缩短至关键性的临界长度后，衰老过程则加速。研究表明，衰老细胞中的一些端粒丢失了大部分端粒重复序列之后，致使那些细胞的老化速度加快，于是就出现一个人身体各个部分的衰老速度不一致的现象。细胞每一次分裂，都会使端粒变短一些，分裂一次，缩短一点，就像磨损铁杆一样，如果磨损得只剩下一个残根时，细胞就接近衰老而无法分裂。

2）什么是端粒酶？

细胞中存在一种酶，它能够促进合成细胞端粒。各个细胞端粒的长短，是由这个酶决定的，这个酶就是端粒酶。细胞内端粒酶的活性高低，可影响细胞端粒的长短，并进一步影响细胞的正常分裂、复制与繁殖。端粒酶在保持细胞端粒稳定、基因组完整、细胞的长期活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒酶的活性高，就能够增强体内细胞的增殖能力，细胞分裂与复制的能力也大，若端粒酶的活性足够高并且持续的时间足够长，还能够使濒临死亡的细胞再度修复、再度复活，从而使人体细胞保持旺盛活力、有效延缓衰老。

端粒酶的存在，可以滋养、修复和延长细胞端粒，让细胞端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂克隆复制的次数增加。

3）端粒、端粒酶与人体关系

细胞端粒的长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关。端粒酶是使端粒延伸的反转录DNA合成酶，是个由RNA和蛋白质组成的RNA-蛋白复合物。简单地说，细胞要分裂复制，就需要细胞DNA内的端粒有足够长度，否则细胞就无法分裂，这个细胞就会很快衰老、死亡。在正常情况下，细胞端粒的长度足够，细胞的DNA分子通过复制程序就能准确无误地生产出自己的副本。在细胞分裂时，可将相关的遗传信息传递给子代细胞，从而保持了细胞的健康接力。“龙生龙，凤生凤，老鼠的孩子会打洞”说的就是细胞复制的意思，是对遗传的最好注解、最恰当的比喻。

1．2端粒延长机制与端粒酶的发现

在1984年报道酵母端粒序列的同一篇文章中．Elizabeth

H．Blackburn还发现，不论是四膜虫还是酵母自身的端粒序

列都可以在酵母中被保护和延伸。而带着四膜虫端粒的DNA

人T染色进入酵母后。其末端会被加上酵母的而非四膜虫的

端粒重复序列13I。此后，同源重组、转座元件、端粒回文或发卡

结构等很多关于端粒复制分子机制的假说和模型相继被提

出。由于端粒是由重复序列组成的．所以当时人们普遍倾向

于同源重组机制的假说。但同源重组只能复制自身的序列，

而对于四膜虫端粒被加上酵母端粒序列而不是四膜虫本身

端粒序列的现象，同源重组假说根本无力解释。那么会不会

是酵母中存在一种从未被发现的“酶”来复制端粒DNA呢要

证实这个假说，最有效的方法就是找到这个“酶”。

1984年，Carol W．Greider作为博士研究生进入Elizabeth

H．Blackburn实验室．开始了端粒末端合成机制的研究工作。

假设端粒是由某种酶合成，那么在细胞裂解液里应该有这种

酶的存在．如果使用四膜虫细胞裂解液在体外能检测到端粒

序列的复制和延伸．那无疑证实这种“酶”的存在并推翻同源

重组的假说。Carol W．Greider和Elizabeth H．Blackburn沿着

这种思路。并根据四膜虫rDNA端粒重复序列，人工合成了其

互补重复序歹d[TFGGGG],寡聚核苷酸，将其作为端粒合成起

始的引物与高浓度的四膜虫细胞裂解液一起孵育，通过放射

性标记的核苷酸来检测体外端掌6=序列的合成。结果显示，当

四膜虫细胞裂解液加A．[1TGGGG]4或酵母端粒序列DNA时，

其明显被重新加上了DNA碱基．而且以6个碱基递增的方

式延长，与四膜虫端粒重复基本单位为6个碱基正好吻合，

而对于随机序列的DNA引物则并不发生延伸1141。实验结果证

明，端粒DNA的延伸是通过“酶”来完成的，否定了同源重组

的假说。这种酶后来被命名为“端粒酶”(telomerase)。

随后．Carol W．Greider和Elizabeth H．Blackburn继续研

究端粒酶的特性。她们通过RNA酶降解四膜虫裂解液样品

中的RNA．结果发现端粒酶活性竟然消失了，这证明端粒酶

活性依赖于RNA[蜘峒。当时知道端粒酶依赖于蛋白，因为蛋白

酶消化后的样品也不具备端粒酶活性fi4j。端粒酶活性同时依

赖其RNA和蛋白成分，这种特性与核糖核蛋白复合体非常

相似。Carol W．Greider和Elizabeth H．Blackbum据此推测其

中RNA很可能决定了端粒重复片段的序列。1989年，Caml

W．Greider通过跟踪端粒酶活性．用柱子纯化并成功克隆了

四膜虫端粒酶RNA．发现其中一段RNA序列为C从CCC．

CAA．正好与四膜虫的端粒DNA序列互补，端粒酶可能是利

用这段序列作为模板复制端粒DNN切。之后，Elizabeth H．

Blackburn研究小组发现，将这一RNA序列进行突变后会直

接导致端粒序列的相应改变118I。这证明端粒酶RNA组分作为

模板存在于端粒酶复合体中。

端粒酶RNA功能被确定后，其蛋白亚基的鉴定成为下一

个研究目标。既然端粒酶能够利用RNA模板亚基来复制

DNA．那么很容易推测这个蛋白亚摹可能具有逆转录酶的活

性，其中应该包括逆转录酶特有的结构域。1989年，Jack W．

Szostak实验室利用一系歹『J遗传学筛选方法，在酵母中找到了

邱r 1基因。这个基因突变会导致细胞分裂过程中端粒序列

不断缩短。染色体缺失频率增加，最终出现细胞衰老和死亡

的表型四。同时．Elizabeth H．Blackburn实验室在四膜虫上发

现一个突变会引起相似的表型，这说明端粒可能在维持基因

组稳定性和细胞增殖方面发挥着重要作用旧。此后，多个实验室参与到端粒酶蛋白亚基的寻找丁作

中。1996年，Ceeh实验室用生化手段纯化了四膜虫端粒酶复

合体，其中有一个蛋A根据分子量命名为p123m。同一时期，

在酵母中几个与端粒复制密切相关的基因脚r 2，嬲丁3和

耶T4相继被发现12“。四膜虫蛋白p123及酵母Est 2蛋白后

来被证明是端粒酶的催化亚基：它们含有逆转录酶的结构

域．如果对该结构域的关键氨基酸进行突变，则端粒酶活性

消失五。此后，人们用体外转录和翻译系统共表达了端粒酶的

催化亚基和RNA亚基，在体外重建了端粒酶活性，证明这两

个核心亚基是端粒酶活性所必须的条件嘲。

端粒与端粒酶的一系列发现完美地解释了两个问题：染

色体末端由简单重复的端粒序列构成，端粒保护着染色体末

端使之区别于一般的断裂染色体末端，从而不被各种酶降

解，相互之间也不发生融合：端粒酶负责端粒的复制，端粒酶

的催化亚基利用端粒酶自身的RNA亚基为模板不断复制出端粒DNA，从而弥补在染色体复制过程中的末端缺失．保证

染色体的完全复制。

1 端粒(telomere)

11 端粒(telomere) 的概念

端粒是指真核细胞线性染色体末端的蛋白质-DNA特殊结构，即染色体末端DNA 序列的多个重复，其作用是保护和稳定染色体的末端，它由2～20kb 串联的短片段重复序列(TTAGGG) n 及一些结合蛋白组成。四膜虫(单细胞生物) 端粒的结构是6 个核苷酸5′- TTGGGG - 3′序列的多次重复。人类为5′-TTAGGG- 3′序列的多次重复。随着细胞不断分裂，染色体复制次数增加，端粒DNA 序列进行性缩短。故粒端长度决定了细胞寿命，至一定长度时，细胞停止分化，并出现程序性死亡(细胞凋亡，Apoptosis) 。端粒作为细胞的“有丝分裂钟”(mitosis clock) 调节细胞分裂。早衰的端粒长度明显低于正常人，而人精原细胞的端粒长度比体细胞长数千kb，并不随年龄增长而递减[2]。

12 端粒的结构、功能

1978年，Blackbum发现一种单细胞池塘生物四膜虫的染色体端粒DNA 为一种简单核苷酸序列的大量重复，即(TTGGGG)n，后来证明人和脊椎动物的端粒均为含有丰富鸟嘌呤(G) 的重复DNA 序列，人类端粒DNA 由5′TTAGGG3′的重复单位构成，细胞中端粒DNA 总是和非组蛋白成分的蛋白质结合成一个复合体，其结构虽不清楚，但它有重要的作用，可以保护染色体末端不被核酸酶降解，防止染色体末端丢失、融合，并参与染色体在核内定位及基因表达调控的作用，从而保持遗传系统的稳定性。

2 端粒酶

21 端粒酶的概念

Kim等(1994) 建立了能稳定、成批、快速分析各组织端粒酶活性的Trap 法，这是Kim 等巧妙引用了PCR 技术形成的粒端重复扩增分析法。端粒酶活性的调节所知甚少，调节细胞凋亡的存活因子Bcl-2可能对端粒酶的激活有正相调节功能。

22 端粒酶结构、功能

端粒酶是一种依赖于RNA的DNA聚合酶，目前认为它由三部分组成：端粒酶RNA组分、端粒酶相关蛋白、端粒酶催化亚基。人类端粒酶基因定位在5P15·33，其编码了1132 个氨基酸的多肽，它是以RNA 为模板的逆转录酶，通过识别端粒单链的富G区引物，合成多个端粒重复序列到3′端，所以端粒酶有端粒再生的作用。人类胚胎发育的早期，很多组织可检测到端粒酶活性，但随着人类组织和细胞的分化，端粒酶活性迅速降低，到成人，仅有包括生殖细胞在内的少数细胞或细胞系仍具端粒酶活性，大多体细胞已检测不到。

3 端粒酶活性的测定方法

最初采用的标准检测端粒酶的方法是：分析细胞提取液在引物3′ 2末端上合成重复序列的能力，通过放射性核苷酸标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影的观察，结果端粒酶酶促反应呈现出6 个核苷酸合成的脉冲性，因而形成典型的间隔6 个核苷酸的端粒酶条带模式图谱。尽管用这种方法检测原代肿瘤样本中的端粒酶较为困难，但还是有两个研究小组设法用该项技术证实了卵巢上皮癌与恶性造血细胞癌的提取物中有活化的端粒酶[3]。此外，亦有人用放射性标记的特异性探针进行原位杂交，通过检测组织细胞中RNA 表达水平来反映端粒酶的有无[4]。人类细胞中正常的46 条染色体，即有92个端粒。通过检测不同组织类型细胞中染色体端粒的平均长度，可以间接地检测端粒酶。端粒DNA 长度的测定，一般采用染色体末端限制片段分析法，以(TTA GGG) 4 为探针的Southern 杂交进行分析，该法的缺陷在于永生细胞中端粒长度并不能真正反映端粒酶的活性。目前，测定端粒酶活性主要采用Kim 等建立的端粒重复序列扩增法。该法采用了两项革新技术，极大地提高了端粒酶分析的敏感性(提高了104倍)。首先是对抽提物的准备和预处理，使用去污剂裂解细胞，从少量的细胞中提取有效的端粒酶(旧法采用的是低渗裂解)；最主要的突破是允许一个端粒酶反应的产物以倍增指数方式进行扩增。这种扩增是通过应用一个端粒酶催化的引物，延伸反应产物作模板进行PCR，通过连续的以寡聚核苷酸为引物的DNA 合成，扩增产物进行电泳，以此来反映端粒酶的活性。该法涉及到的两对引物是: 正向引物为5′ 2AA TCCGTCGA GCA GA GTT2 3′和反向引物为5′ 2 ( CCCTTA ) 3 CCCTAA 2 3′。本法具有敏感、快速、高效的特点，但易受各种外来因素的干扰和同位素污染。最近Iwama 等对TRA P 法又进行了改进，采用内部端粒酶测定标准的荧光端粒重复扩增法，可克服此点之不足，且可进行半定量分析，是检测端粒酶活性较为理想的方法。

4 端粒酶与肿瘤诊断和治疗

由于端粒酶活性见于绝大多数恶性肿瘤，而人正常体细胞中未见该酶活性，端粒酶活性为恶性肿瘤的诊断和治疗带来了希望。首先，端粒酶活性的检测有希望成为早期恶性肿瘤诊断和判断肿瘤预后的标志物。例如端粒酶活性的检测可作为筛选早期恶性肿瘤的标志物，若能将转移癌细胞与外周血细胞分开亦可作为早期转移癌的标志物。大约20%～30%乳腺癌不伴有腋窝淋巴结转移的病例未见有端粒酶活性，同时伴有腋窝淋巴结转移的乳腺癌病例其端粒酶活性的检出率超过95%，表明端粒酶可作为独立的判断乳腺癌预后及复发的指标[5]。术前对组织进行端粒酶分析可给外科医生提供更多的信息，敏感的端粒酶分析法可用于细针穿刺组织使得术前判断病人预后成为可能。其次，由于端粒酶活性是保持绝大多数恶性肿瘤细胞继续生长必须之酶，抗癌药物建立在抑制端粒酶活性的基础上可能会得到高效治疗效果和最低的副作用。端粒酶在生殖细胞和其它永久存活细胞内的功能是保持端粒长度，使细胞能不断地分裂。目前看来该酶是治疗癌症比较特异和明确的目标[6～9]。虽然要考虑到抑制肿瘤细胞端粒酶活性的同时也抑制了生殖细胞和造血干细胞端粒酶活性，但是此治疗设想比现用治疗的毒性和副作用低，通常的化疗除了对干细胞有作用外，对所有增生的细胞均起作用。用端粒酶抑制剂会减轻或避免常规化疗所引起的恶心、脱发等副作用。应该考虑到端粒酶抑制剂一定在端粒缩短到一定程度端粒酶被激活后，才能发挥效应，所以可能需要一段时间。设计用该酶抑制剂治疗肿瘤首先应设法加快肿瘤细胞端粒的缩短速度，以尽快使抑制剂发挥作用达到治疗肿瘤的目的。

5 端粒酶的基因研究初步概况

编码端粒酶全酶的整个基因仍未被人们所认识。但目前认为，端粒酶为RNA 依赖性DNA 聚合酶，端粒酶的亚单位工作是以RNA 为模板合成端粒DNA 片段。在许多生物中包括人类编码端粒酶的这段RNA 模板基因已被克隆。除此之外，还确定了与激活端粒酶有关的3种相关蛋白：P80、P95 和TP1。P80和P95蛋白已从纤毛四膜虫中纯化。编码与P80 相似的哺乳动物的TP1 蛋白的基因已克隆成功。迄今为止这些蛋白在端粒酶中所起的确切功能尚不得而知 。哺乳动物TP1 蛋白与四膜虫P80蛋白的氨基酸顺序极为相似。TP1 蛋白表现出与哺乳动物端粒酶RNA 的特异性结合。TP1 的抗血清与有端粒酶活性的细胞提取液显免疫沉淀反应，提示TP1 在体内与端粒酶密切相关。

综上所述，近几年，端粒及端粒酶的研究引起分子生物学家的浓厚兴趣，在酶的三维结构预测、基因的克隆、种系的发生，都取得一定进展[10～12]。在对影响端粒长度的各种分子之间相互作用机制阐清的基础上，相信端粒及端粒酶的研究必将在延长细胞寿命、肿瘤检测与诊治、基因治疗等方面取得广泛的应用前景。

端粒酶软胶囊，其中含有的成分就是端粒酶，可以说，通过端粒酶，可以直接增加细胞的年轻活力，从而能提升细胞的年轻态，使得人们身体内的细胞会再次的生长。尤其是可以直接提高人体的各项机能，对延缓衰老，以及加快细胞的生存是有功效的，尤其是可以促进身体内的活性成分，对预防各种疾病都是由效果的。而且端粒酶与细胞之间还会由一定的关系，端粒越长，那么细胞就会有活力，所以说能直接通过这样的端粒酶软胶囊，从而能够解决细胞老化的问题。端粒酶软胶囊什么作用，这款产品的主要作用，就在于可以为人们的身体提供缺失的端粒酶，只要人体内能补充充分的端粒酶，就可以对自己的身体细胞有不错的功效，从而能恢复年轻体态。