关于植物油体蛋白表达纯化体系

植物油体表达体系的研究进展

刘昱辉、贾士荣

中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

摘要：介绍了植物种子中油体和油体蛋白（oleosin）的结构特征及其编码基因的调控，阐述了用植物油体表达体系这一新型植物生物反应器生产目的蛋白的研究进展和前景。

关键词：油体；油体蛋白；表达体系；植物生物反应器；目的蛋白

现有外源基因表达系统主要包括：细菌、丝状真菌、酵母、哺乳动物细胞、动物乳腺、昆虫（昆虫细胞、昆虫杆状病毒和昆虫整体）和植物表达系统（植物整体、病毒载体和油体）等。这些外源基因表达系统在表达量、表达产物的分离纯化及活性、成本等方面各有优缺点。从近年的研究进展看，利用植物表达系统大规模生产各种目的蛋白还受到诸多因素的限制，表达量低、提取和纯化成本高是主要的限制因素。植物油体表达体系将目的蛋白的编码基因插入油体蛋白（oleosin）编码基因的3`端，以oleosin启动子驱动目的蛋白与oleosin一起在转基因植物的油体中特异表达，获得转基因植物种子后，将种子粉碎， 利用油体的疏水性，离心将油相和水相分开，回收上层油体部分，即可去除种子中大部分的非目标成分，从而显著降低目的蛋白的分离纯化成本，因此近年来倍受关注。作为一种新型的植物生物反应器，为最终利用转基因植物生产外源蛋白提供了新的途径。

1 油体（oil body）

植物种子中贮存的营养物质主要包括蛋白质、脂肪和碳水化合物。其中脂类物质一般以三酰甘油（triacylglycerols,tag）的形式存在，荷荷芭（jojoba）例外，它贮存蜡酯（wax esters）。种子中的tag分子之间不是彼此聚合的，而是分散成许多小的稳定的亚细胞微滴，被称为油体。油体作为生物体中最小的细胞器有其自身的结构和特征。

11 油体大小

油体为直径05-25μm的球体，其大小因植物种类的不同而不同，且受营养和环境的影响。即使同一粒种子，不同组织中的油体大小也不相同。从生物学角度讲，油体的大小主要决定于两个因素：（1）种子发芽时为脂酶催化tag提供最大的作用表面；（2）消耗最少量的油体蛋白和磷脂（phospholipids, pl）。如果油体的直径小于02μm，虽可为脂酶的催化提供更大的作用表面，但却需耗费大量pl和oleosin。相反，如果油体直径大于25μm，虽节省了pl和oleosin的用量，但由于作用表面过小，在种子发芽及幼苗生长时，脂酶不以迅速水解脂类为植物提供生长所需的能量。

12 油体成分

油体的成分包括：（1）92%-98%的中性脂类：主要为tag，约占95%，少量的二酰甘油（dag）和自由脂肪酸；（2）1%-4%的磷脂（pl）：主要为磷脂酰胆碱，约占60%-70%，少量的为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇；（3）1%-4%油体蛋白：其中90%为oleosin，少量的为caleosin、细胞色素c还原酶等。某些植物（如蓖麻和大豆）成熟种子的油体膜上还有脂酶和酰基脂酶存在。花粉粒油体中未检测到oleosin，橄榄和鳄梨果实中皮层油体中也没有oleosin。由于这些油体中的脂类物质不是用于长期贮存，因此murphy和vance提出oleosin可能仅为储藏器官油体所特有，但næsted等发现根尖油体中有oleosin存在。

13 油体的基本结构

根据tzen等提出的油体结构模型，油体内部为液态tag，外部是由单层磷脂分子及其镶嵌蛋白-oleosin组成的半单位膜，这个半单位膜的基本单位是由13个pl分子和1个oleosin分子组成（图1）。pl占油体表面的80%，其余20%是oleosin。每个pl分子的2个疏水酰基朝向内部疏水的tag基质，与tag分子相互作用；pl亲水的头部基团朝向胞浆。oleosin分子中间的疏水区域形成一个约11nm的柄状结构占oleosin分子的2/5，伸入pl的疏水酰基部分及油体内部的tag中，该部分为由68-74个氨基酸组成的发夹结构，发夹结构的顶端是由3个脯氨酸和一个丝氨酸构成的“脯氨酸结”（图1）。oleosin分子其余的3/5部分则覆盖在油体表面，阻止外部的磷脂酶作用于磷脂半单位膜。等电聚焦结果显示，油体的等电点为57-66，即在ph值为中性时，油体表面带负电荷。植物种子经长期贮存，油体结构仍保持稳定，彼此之间不会相互聚合，普遍认为油体表面电荷和oleosin蛋白的存在是维持油体结构稳定的主要因素。最近的研究结果显示，油体表面除主要镶嵌有oleosin外，还镶嵌少量其它蛋白，如caleosin，因此油体作为植物中最小的细胞器，其结构可能较上述模型更加复杂。oleosin和caleosin是迄今为止研究得较多的两种油体蛋白。

2 油体蛋白

21 oelosin及其结构特点

oleosin最早是从芥菜中发现的，目前许多种植物（如芝麻、油菜、向日葵、胡萝卜、玉米、大豆、拟南芥和棉花）的oleosin基因序列和氨基酸序列均已报道。oleosin是高度疏水的碱性小分子量蛋白，分子量为15-26kd，主要在种子中特异表达。一般认为oelosin为油体所特有， 最近发现约有5%的oelosin存在于靠近油体的内质网上，另外在根尖油体中也发现有oelosin存在。oelosin是在内质网上合成的，由与内质网结合的核糖体负责合成。oelosin镶嵌在油体表面，对维持油体的稳定极为重要，一方面在空间上阻碍油体分子间相互聚合，另一方面在种子发芽时，oleosin被认为是脂酶与油体间的结合位点。某一植物中含量最高的oleosin的抗体也能识别同科植物中分子量相近的oleosin，如十字花科的19-20kd、菊科的20kd和豆科的24kdoleosin；不仅如此，不同科间的oleosin也可发生这种交互反应。

不同植物来源的oleosin蛋白具有相同的结构特性，都具有3个基本的结构域，即（1）n端40-60个氨基酸组成的两亲性区域（兼具亲水性和亲脂性）。这一区域分布于油体朝向胞浆的一面。（2）中间68-74个氨基酸组成的高度疏水区域。tzen和huang根据这一区域中氨基酸残基极性的分布，推测其为伸入tag基质中的反式平行的β-折叠结构，其顶部具有由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的“脯氨酸结”。这一区域尤其是“脯氨酸结”在不同来源的oleosin中高度保守，因此从进化上讲，该区域可能对植物有重要意义。（3）c端的33-40个氨基酸组成α-螺旋结构域。该结构域兼具亲水和亲脂性，其带正电荷的基团朝向pl层带负电荷的部分（磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、自由脂肪酸等），带负电荷的部分朝向油体表面（图2）。对每个oleosin蛋白分子而言，约20%的氨基酸残基镶嵌在pl层上，30%浸在tag中，其余50%暴露在油体表面。对oleosin二级结构进行的生化分析支持tzen的这一模型。lacey等提出新的oleosin二级结构模型：即oleosin中部疏水区域是由“脯氨酸结”连接的两个分开的α-螺旋结构，并由这个“脯氨酸结”形成180度转角；n端为β-折叠结构；c端是兼具亲水和亲脂性的α-螺旋结构，上述两种模型均有待进一步的实验验证。

22 oleosin基因及其表达调控

研究发现裸子植物中只有一种oleosin，被子植物中的oleosin基因常以基因家族的形式存在，一种植物中常有几个oleosin异构体（表1）。各异构体在植物中的表达量、表达部位及表达速度均不相同。如玉米中18kdoleosin的表达量仅为16kd的10%-20%，油菜油体中24kdoleosin仅为20kd的10%。

oleosin基因表达调控的特点：

（1）oleosin基因主要受发育调控，在种子成熟过程中表达。oleosin基因受水分逆境、茉莉酮酸、aba和渗透稳定剂（如山梨糖醇）诱导表达，如油菜的20kdoleosin基因受aba诱导后0-4h检测到mrna和蛋白质积累；渗透稳定剂（如山梨醇）处理1h可测到mrna，3-6h检测到oleosin蛋白的积累。在油菜和拟南芥oleosin基因的启动子区均存在abre（aba-responsive element）基元序列（t/c acgtggc），特异地受aba诱导。（2）oleosin基因的表达具有组织特异性，主要在种子的胚（盾片和胚轴）及糊粉层中表达，de-oliveira等、robert等报道在花粉中发现有一类特殊的oleosin。油菜小孢子培养来源的球形胚和心形胚中可测出20kd的oleosin，心形胚中可测到相应的mrna，说明oleosin在种子发育的早期就有表达。（3）oleosin基因5`端上游区域还具有其它调控序列，如在水稻oleosin基因上游存在谷物贮藏蛋白基因的调控元件catgcang。油菜oleosin启动子上存在的aatgcatg序列，与控制豆科植物基因种子特异表达的保守序列ry基元序列（catgcatg）高度同源。拟南芥oleosin基因启动子上存在豆科植物种子蛋白普遍具有的caca（taacaca）序列。（4）oleosin基因虽为组织特异表达，但其5`端却没有信号肽序列存在，与此相应的是oleosin蛋白n端也没有剪切信号序列，推测oleosin基因内部可能有某些序列，或者oleosin蛋白能够形成某种构象使其定位到油体表面，例如oleosin中部缺失，严重影响其在油体上的定位，而n端或c端缺失则影响较小或根本无影响。“脯氨酸结”中的3个脯氨酸突变为亮氨酸的实验，证明“脯氨酸结”为oleosin定位于油体所必须。oleosin中部疏水区域可能是oleosin的内质网定位信号，但在体外实验中，“脯氨酸结”突变不影响oleosin内质网上的定位。

23 caleosin

用不同方法分离多种植物油体蛋白，发现除oleosin外，还含有少量其它蛋白。1998年chen等首次以免疫标记法确定了芝麻油体中的另外3个种蛋白sop1、sop2和sop3。sop1经氨基酸序列测定，发现它与水稻的一个钙结合蛋白同源，因此将这类蛋白命名为caleosin。 caleosin在高等植物中广泛存在，藻类和真菌中也有类似蛋白。不同来源的caleosin表达特性不同。如水稻caleosin主要在胚形成后期表达，受aba或水分逆境诱导可在幼苗和营养生长组织中表达。与水稻caleosin水同，芝麻caleosin似乎仅为种子特异表达。干旱状态下，拟南芥受aba诱导可检测到caleosin同源蛋白mrna。已知高等植物caleosin蛋白分为3个结构域：（1）n端亲水区，含有一个与ca2+结合的ef-hand。大肠杆菌中表达的ef-hand融合蛋白，在体外实验中可与ca2+结合。从芝麻油体中分离得到的caleosin1也能与ca2+结合。（2）中部疏水区，该区包括n端的一个胞外膜定位区和与之相邻的一个富脯氨酸区。已知这一结构仅存在于某些高等植物如芝麻、水稻和拟南芥的caleosin。（3）c端亲水区。多数植物caleosin的c端亲水区一般都包括4个激酶磷酸化位点。不同来源caleosin的结构和生物学功能尚不清楚，推测可能参与油体生物合成、脂类的胞内运输和代谢。

3 植物油体表达体系

31 oleosin目的蛋白表达载体的构建

如前所述，所有oleosin均有3个结构域，3个结构域加起来约15kd，但oleosin分子量的判别却很大（15-26kd），多出的1-11kd以c-端或n-端的延伸形式存在。不同来源的oleosin除中部疏水区域高度保守外，n端和c端核苷酸序列差异很大。这使人们想到，将外源小分子量蛋白编码基因插入oleosin基因的5`端或3`端，构建由oleosin启动子驱动的“oleosin目的蛋白”植物表达载体，转化受体植物，不会影响oleosin在植物油体上的定位。由于oleosin为种子特异表达，并镶嵌在油体表面，目的蛋白在转基因植物中是以融合蛋白的形式与oleosin一起在油体中特异表达。

32 植物油体表达体系的优点

321融合蛋白易于分离 oleosin为种子特异蛋白表达，并镶嵌在油体表面。外源基因插入oleosin的n端和c端，构成融合蛋白并未改变oleosin的特性。因此利用油体亲脂疏水的特性，将转基因植物种子经粉碎→液体抽提→离心处理，回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开，可去除90%以上的种子蛋白。当融合蛋白中插入的目的蛋白为酶时，oleosin-融合蛋白可直接作为酶使用，酶催化反应结束后还可回收，用于下一次酶促反应（作为固定化酶），一般重复使用2-3次后，仍保持较强的酶活力。若融合蛋白不具活性，则需将目的蛋白从oleosin上切下来。为此，需在目的蛋白和oleosin基因之间引入一个蛋白酶酶切位点，比较常用的是溶血酶（thrombin），融合蛋白经酶切后，再设法将两者分开。

322融合蛋白在种子中可长期稳定贮存 成熟种子中水解酶活性降低，因此融合蛋白可在种子中长期稳定贮存而不会被降解。据van rooijen和moloney报道，oleosin-gus（β-葡糖醛酸苷酶）融合蛋白在转基因油菜种子中4℃贮存1年以上，也不降解。

323种子易于运输，有利于工业化生产 种子成熟过程中95%以上的水分被蒸发，较植物的其它部分更易于运输，为大规模生产目的蛋白带来方便。

324现在加工机械适用于种子粉碎和油体的分离 例如谷物的加工粉碎用水磨，而乳制品工业中用于分离奶制品的设备可用于液体抽提后油体的离心分离。

325增加农产品的附加值 分离目的蛋白后的油体仍可作为食用油或工业用油，目的蛋白则可大大增加农产品的附加值。

33 用植物油体表达体系已表达的外源蛋白

1991年lee等首次报道将玉米的oleosin基因转入油菜，玉米oleosin的mrna仅在转基因植物成熟种子中存在，表达量为种子总蛋白的1%，表达产物90%定位在油体上。单子叶植物玉米的oleosin基因在转基因油菜油体上的正确转录、翻译和定位，说明单子叶来源的oleosin基因上有足够的信息可以使它在双子叶植物中起作用。1996年holbrook等用基因枪轰击油菜种胚，在短暂表达检测中发现oleosin-gus融合蛋白在油体上正确定位，进一步验证了lee等的实验结论果。vanrooijen和moloney将gus基因插入拟南芥oleosin基因的3`端，构建以oleosin启动子驱动的植物表达载体，以农杆菌介导法转化油菜，在转基因植株中80%的gus活性在油体上。该实验还发现oleosin-gus融合蛋白本身就具有β-葡糖醛酸苷酶的活性，而不必将gus从oleosin上切下来。由于融合蛋白结合在油体上，因此可作为固定化酶多次重复使用。1995年parmenter等构建了由拟南芥oleosin启动子驱动的oleosin-水蛭素融合蛋白表达载体，转化油菜，经免疫荧光检测，融合蛋白定位在油体表面，表达量占种子总蛋白的1%。将水蛭素与oleosin蛋白酶切分离后，得到具有生物学活性的水蛭素。该实验发现虽然oleosin-gus融合蛋白具有生物学活性，但oleosin-水蛭素融合蛋白却没有水蛭素特有的抗凝血酶活性，必需将其从融合蛋白上酶切下来。1997年liu等利用植物油体表达体系在转基因油菜中成功地表达了来自瘤胃真菌的木聚糖酶。

34 受体作物和目的蛋白的选择

受体作物应选择油脂含量高、遗传转化容易的作物。目的蛋白的选择应考虑：（1）分子量不宜太大，以防影响融合蛋白在油体表面的正确定位。目前利用油体表达的目的蛋白最大的是67kd的gus；（2）目的蛋白应有一定的亲水性，尤其当需将目的蛋白从融合蛋白上切下时；（3）功能清楚，基因序列已知；（4）价格昂贵，有良好的商业价值，可显著提高农产品的附加值。

基于以上考虑，我们实验室选择以油菜、棉花为受体。为研究植物油体表达体系的适用性，我们选择以c端需酰胺化才有生物学活性的降钙素作为目的蛋白，目前已获得转基因棉花第4代株系和转基因油菜植株。转基因油菜经pcr检测，证明降钙素基因已整合到油菜基因组中。转基因棉花经pcr-southern和western检测，证明目的基因已在棉花中整合并在油体中表达。转基因植株中目的蛋白的表达量和生物学活性检测正在进行中。“一种新型鲑鱼降钙素类似物及利用植物油体表达体系生产外源蛋白的方法”已申请国家专利（另文报道）。

4 前景和问题

用油体表达体系成功地表达gus、水蛭素、木聚糖酶、降钙素等外源蛋白，尤其是与固定化酶技术结合，无疑使人们看到了其在工业化生产目的蛋白方面的应用前景，但作为一种新型植物生物反应器，还有许多问题需要进一步的研究和探讨，包括：（1）如何进一步提高蛋白表达量和降低目的蛋白的分离纯化成本。当oleosin-融合蛋白不具生物活性时，这一问题就更加突出，目的蛋白酶切、分离和纯化成本高，将严重影响这一体系的实际应用。（2）已知有些蛋白糖基化、酰胺化后才具有生物活性，油体表达体系中目的蛋白能否糖基化和酰胺化以及糖基化、酰胺化程度如何，还有待更多的实验研究。油体表达体系的局限性还表现在对目的蛋白的分子量、亲水和疏水性有一定的要求。没有一种表达体系是万能的，如何扬长避短，充分利用不同表达体系的优点，表达适当的目的蛋白以造福人类，这是今后需要深入研究的课题。

摘自：《农业生物技术》2003，11（5）：531-537

（Yeast artificial chromosomes YACs）PYAC4 遗传结构图

YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14×106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。

1．YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因

在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。

YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：

·端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

·着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

·自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。

YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。 （Bacterial artificial chromosomes，BACs）

1．F 质粒

大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al 1992 ），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。第一代 BAC 载体 （Shizuya et al 1992） 不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 （Kim et al 1996; Asakawa et al 1997） 。 Not Ⅰ 识别序列，位点十分稀少。重组子通过 Not Ⅰ 消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。图 3-28 是 pBeloBAC11 遗传结构图。

BAC 与 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色体 ） 相似，没有包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。

F 质粒能够编码形成性菌的蛋白，通过大肠杆菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。 BAC 载体空载时大小约 75kb ，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 BAC 载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互补筛选。

三、P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体 （Bacteriophage P1 vectors）

是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70～100kb 大小的基因组DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb （包括载体和插入片段）。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r ，一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子（ P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DNA 分离前质粒的扩增。图 3-29 是 P1 噬菌体载体 pAd10sacBII 的遗传结构图。2．P1 人工染色体（P1 artificial chromosomes）

结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持 （Ioannou et al 1994） 。基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb～150kb 之间。

载体

拼音

zài tǐ

解释

指能传递能量或运载其他物质的物体。 在生物、化学以及IT等领域中，有其固有的含义。

生物

载体（vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

化学

载体（vector） ，能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质。在气态物质的分离过程中也称为载气。放射化学研究中核衰变和核反应过程生成的元素的量通常极少，大约为10-8～10-12克，这些物质即使在溶液中可以生成某些难溶化合物，但由于数量少而不能形成独立相，它可能吸附于器壁或其他颗粒的表面上而丢失，因此不能用普通沉淀的方法进行分离。为了克服这些困难，可引入载体，形成共沉淀而进行分离。被称为“分子运输车”。

IT

在信息技术和通信系统中，通常把信息的发生者称为信源,信息的接受者称为信宿,传播信息的媒介称为载体。

随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。

1 转染的分类：物理介导、化学介导和生物介导三类途径。

物理介导：电穿孔法、显微注射和基因枪法；

化学介导：经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；

生物介导：较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

2 三种转染方法具体介绍：

电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入（实验条件控制较严、难度较大）；

脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞（常用，质体与质粒的比例，细胞密度，转染的时间长短和培养基中血清的含量都影响转染效率）；

病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞（前期准备较复杂、对细胞可能有较大影响）；

3质粒：真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。

包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)，质粒上常有抗生素的抗性基因，例如氨苄抗性基因或 卡那霉素 抗性基因等。

4病毒转染：外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。可用于RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究，稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验。

慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。前者能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；后者同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

步骤： 1 ）构建载体 2 ）包装提纯病毒 3 ）感染靶细胞

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

5 质粒转染和病毒感染异同：

（1）质粒转染：相对简单的基因传递方式，与病毒载体主动进行细胞攻击侵染方式不同，质粒转染属于被动扩散。

优点：质粒载体构建流程相对简单，速度快（病毒载体都需要先构建载体后包装成病毒颗粒）

缺点：a在细胞水平，质粒转染效率不稳定，不同细胞依照不同的转染方法和转染介质，效率差别较大，且大部分方法效率不高；

b质粒转染一般入核效率低，特别是阳离子脂质体，阳离子聚合物等介质，电转质粒入核的效率则比介质转高不少，但比起慢病毒转染，效率仍然低很多，且对细胞损伤较大。

（2）病毒载体转染：病毒粒子是病毒壳（介导细胞转导/引入整合酶/介导体内靶向转导）+目的基因的复合物，不用或者用简单的试剂就能完成基因导入。

优点：转染效率高，应用不同的病毒载体工具可实现细胞和动物的高效转导和稳定转导。

缺点：不同的病毒载体的包装需要比较复杂流程和工艺优化，相对技术门槛较高。

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。

与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。

简单和复杂的逆转录病毒都含有两份线性、不分节段的、长7-12 kb的单链RNA，编码gag, pol和env基因。

Gag 编码一种多聚蛋白，翻译自一条无拼接的mRNA，mRNA然后被病毒蛋白酶（PR）切割成MA、CA和NC蛋白。

Pol 表达的是Gag-Pol多聚蛋白，编码RT、PR和IN三种酶。这三种蛋白附着在病毒粒子的基因组上。RT蛋白拥有如下三种活性：（a） RNA依赖的DNA聚合酶活性，负责将两条RNA转录成一个cDNA；（b） 核糖核酸酶H活性；（c） DNA依赖的DNA聚合酶活性。PR用于切割Gag和Gag-Pol多聚蛋白，导致病毒粒子的成熟和产生具感染能力的病毒粒子。IN负责将病毒的cDNA整合至宿主细胞基因组中。一旦整合完毕，病毒基因组便与宿主细胞染色体相连，称为前病毒

Env基因 也编码一种多聚蛋白前体，前体被细胞内的蛋白酶切割成表面包膜糖蛋白（SU）gp120和跨膜（TM）糖蛋白gp41。其中，gp120与细胞表面受体和辅助受体相互作用，gp41在病毒膜上与gp120形成gp120／gp41复合体，在病毒进入宿主细胞时催化膜融合。

复杂的逆转录病毒基因组区别于简单的逆转录病毒基因组的地方主要在于前者存在一套附属基因，其产物涉及到转录调控、RNA转运、基因表达与装配。其中包括Rev和Tat蛋白以及Vpu、Vif、Vpr和Nef这些附属蛋白。Rev是一种RNA结合蛋白，保证晚期基因的表达。它还对未拼接的和单股拼接的mRNA的转运来讲非常重要，它编码从核到细胞质的病毒结构蛋白。Tat是一种RNA结合蛋白，起到增强转录的作用。Nef蛋白抑制T细胞激活。Vpu能增强病毒进入过程中从细胞表面到细胞质中的释放。Vif蛋白是慢病毒复制所必须的，因为它能下调宿主的抗病毒反应

慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。野生型慢病毒的 5'LTR 可以驱动病毒基因组的转录， 3'LTR 能够终止上游转录。但LTR可转移到细胞原癌基因邻近处，使正常细胞转化为癌细胞。因此，在慢病毒载体中需要删除5'LTR的部分序列，提高慢病毒载体的安全性。此外，通过删除与病毒包装和转导相关的基因形成复制缺陷型的慢病毒颗粒，限制其在靶细胞中的大量复制，提高生物安全性。

在程序上，慢病毒和逆转录病毒载体的一个重要区别在于：对慢病毒载体，通常包装、包膜和转运质粒共转染入包装细胞系，而对逆转录病毒载体，只有转运载体才转染到细胞系内，而细胞系早已稳定表达另外两种载体

选择转运质粒时，需要关注驱动目标基因的启动子。RNA聚合酶II启动子（如 CMV ）驱动编码蛋白质的RNA的表达。RNA聚合酶III启动子（如 H1或U6 ）驱动更短的转录本的表达，如shRNA。

选择转运质粒时，需要关注驱动目标基因的启动子。RNA聚合酶II启动子（如CMV）驱动编码蛋白质的RNA的表达。RNA聚合酶III启动子（如H1或U6）驱动更短的转录本的表达，如shRNA。

病毒载体可以借助其他病原体的外壳蛋白包装成假病毒，以改变其嗜性。最常用的是疱疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G） 。其他常见的包膜蛋白来源于狂犬病毒、鼠白血病病毒、埃博拉病毒、杆状病毒、麻疹病毒和纤丝病毒。杆状病毒GP64和肝炎E1和E2型假病毒增强肝转导，纤丝病毒包膜型假病毒增强呼吸道上皮细胞或内皮细胞的转导。有趣的是，假病毒还会影响狂犬病毒糖蛋白包被的慢病毒的运输，导致轴突逆行运输 [12] 。

pCMV-VSV-G含有在CMV启动子驱动下表达疱疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)的基因序列，这个基因用于代替原病毒中编码病毒包膜蛋白的基因，可以大幅提高病毒的宿主细胞范围。

注意：由于γ-逆转录病毒和慢病毒gag、pol和env基因间的亚型差异，转运质粒和包装质粒不能够互换。

该系统中还增加了两个元件，分别为来源于旱獭肝炎病毒的转录后调控元件（Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulation element, WPRE）和来源于HIV1整合酶基因的central Polypurine Tract（cPPT）， WPRE 有利于增加蛋白的表达量，而 cPPT 元件则有利于增加病毒的滴度， WPRE 和 cPPT 元件能使蛋白的表达量至少提高4倍。

Ploybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene感染效率可以提高2-10倍。Polybrene有一定的细毒性，有的细胞对polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1-10ug/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞武鸣县毒性反应为最佳，可参考文献并进行预实验摸索，polybrene最常用的工作浓度6-8ug/ml。

这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件 的来激活它。所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的 LTR是Tat依赖性的 。

设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。虽然第3代病毒更加安全了，但是它的效率却降低了。除此之外，第3代病毒删除了 Tat元件 ，并且在目的质粒中引入了一个嵌合了5'LTR的异源启动子。这种目的质粒基因的启动子并不依赖于Tat元件。第3代病毒的目的质粒可以使用第2代或第3代的包装质粒，也就是说第3代慢病毒的目的质粒兼容第2代的包装系统。

Tat基因 由两个外显子构成，编码HⅣ复制和 基因表达 所必须的 反式激活蛋白 (transactivator,Tat），又称反式激活因子（trans-activating factor），能够增强病毒复制的起始，促进mRNA的转录和翻译。 Tat与HⅣ RNA 5’端LTR结合后能够极大地提高HⅣ基因的转录水平。

参考链接： https://wwwjianshucom/p/71e5abdc35dd

解题思路：据图①为提取分离得到胰岛素mRNA的过程，②为逆转录合成胰岛素目的基因，③为转录，④为PCR技术大量扩增目的基因，⑤为重复进行上述操作，⑥为限制酶切割运载体质粒，⑦为将目的基因和运载体连接在一起，形成基因表达载体，⑧将目的基因导入受体细胞，⑨为工程菌的大量培养繁殖，⑩为分离得到目的基因产物人的胰岛素；图中A为胰岛素目的基因，B为运载体质粒，C为基因表达载体，D为导入目的基因的大肠杆菌．

（1）据图分析可知：①为从细胞中获取胰岛素mRNA的过程，由于基因的选择性表达，只有胰岛B细胞能合成胰岛素，故细胞1为胰岛B细胞；过程②为以mRNA为模板逆转录合成胰岛素目的基因，需要逆转录酶，④为PCR技术大量扩增目的基因的过程，需要耐高温的Taq聚合酶．（2）过程②获得的目的基因由胰岛素的mRNA逆转录而来，该mRNA都能编码氨基酸，与人细胞中胰岛素基因相比，无不能编码蛋白质的内含子序列．（3）若A 有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，根据碱基互补配对原则，G=C=b个，则A=T=a-b个，经③④⑤过程连续复制4次，共需要提供24-1=15条DNA分子的原料即可，故至少提供胸腺嘧啶15（a-b）．（4）图中B为运载体质粒，成分是环状的DNA，组成单位为4种脱氧核苷酸，基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，包括⑥剪切和⑦拼接两个过程．（5）图中C为基因表达载体（重组质粒），为了便于重组DNA的鉴定和选择，其上必须有标记基因；⑧为将目的基因导入受体细胞大肠杆菌，常用Ca2+ （CaCl2）处理法．（6）⑨为工程菌的大量培养繁殖，得到使外源基因高效率表达的菌类细胞株系称为工程菌；由于大肠杆菌是原核生物，无染色体变异和基因重组，若过程⑨发生了变异即为基因突变；过程⑩得到的人胰岛素还需要体外加工才具有生物活性，因为大肠杆菌体内没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质加工．故答案为：（1）胰岛B逆转录酶、Taq酶（2）内含子 （3）15（a-b）（4）4⑥⑦（5）标记基因Ca2+ （CaCl2）（6）工程菌基因突变没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质加工

点评：本题考点： 基因工程的原理及技术． 考点点评： 本题考查基因工程、真原核生物区别等相关知识，结合图形进行考察，意在考查考生对所学知识的掌握和分析图文信息的能力．

一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多l 克隆位点：MCS 克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA 作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori 的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记： （1）Ampr：水解β -内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β 失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源DNA 片段。一般来说，外源DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 相关概念： 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA 转录的DNA 顺序，这个DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA 分子上可以与RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子－为真核 l 基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD 序列。 l 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly （A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－ stream 有一段GT 或T 富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 三、载体及其分类 载体：即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 PS基因工程所用的vector 实际上是DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA 片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨型载体）（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的DNA 顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）。 PS 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。 基因工程载体的3个特点： （一）都能独立自主的复制：载体DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如 MCS，插在其中的外源DNA 片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。 （二）都能便利的加以检测： 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。 （三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。 四、载体的选择和制备 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 1、 构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 2、载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如小于10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，Ecoli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意3点： ①选择合适的启动子及相应的受体菌； ②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位； ③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 3、载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。选用质粒（最常用）做载体的4点要求： ①选分子量小的质粒，即小载体（1－15kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒小于10个。 ③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； ④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切 割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。 二、pET32a(+)自身载体表达的片段大小 The expected fusion protein expressed encoded by just the pET-32a(+) vector alone would be around 204 kDa The Trx-tag by itself would contribute 12kDa The rest is due to the two His-tags (08kDa each) and the S-tag (17kDa) The remaining 51kDa is due to the intervening（） 54 amino acids between the tags and until the stop codon 三、pET32系列载体的载体序列地址 四、pET 系列载体阅读方法 ori 是复制起始点，细的黑箭头是几个不同的转录区，其箭头方向不同，说明每个表达产物（如kan 抗性基因、LacI 等）都有独立的promoter，有时与T7 promoter 方向相反。粗的黑箭头是MCS，用于目的基因的插入，箭头方向表明目的基因的转录方向，它的转录方向可以与其它几个不同的转录区相同，也可以不同，如 Kan 抗性基因、LacI 的方向是一样的，可能与调控相关，不同的载体是不一样的。一个载体可只看它的启动子到终止子那一段，其它的可以考虑少些。 五、pET 表达菌株的相关信息 （ DE3 ）指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。 AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。 B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。 BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。 BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。 BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。 HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。 NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。 Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。 Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。 Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。 Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。 详情可咨询生物淘

（1）为了使组织分散开为单个细胞通常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶．

（2）基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因．启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端．

（3）PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、TaqDNA聚合酶和一对DNA引物；在PCR反应过程中，有一个环节是从较高的温度冷却到相对较低的55℃左右，其作用让引物结合到互补DNA链上，形成局部双链．

（4）利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制．通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以增大细胞贴壁生长的附着面积增加培养的细胞数量，也有利于空气交换．

故答案为：

（1）胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 

（2）启动子 终止子 

（3）TaqDNA聚合酶   对干扰素基因特异性的DNA引物对  

（4）增大细胞贴壁生长的附着面积