PEG介导的原生质体转化

此方法首先要获得去细胞壁的原生质体，可用胞壁降解酶除去芽管或菌丝的细胞壁。通常使用的是酶混合物，例如纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶等，这些胞壁降解酶混合使用通常会更好地发挥去壁作用，在原生质体准备过程中，要求渗透压稳定剂。1987年Penttila等第一次在里氏木霉（Trichoderma reesei）原生质体制备基础上利用PEG介导实现木霉的转化，以后的其他研究者的木霉PEG转化大多是在他的基础上进行改良而来，在原生质制备过程中成功使用山梨醇保持渗透压稳定，浓度为12M，MgSO4可以作为替代品。此外，有些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al，1989）。Treesei使用10～12M的山梨醇可有效控制渗透压稳定性，后代再生率为90%。经过PEG转化，原生质体再生率从90%降至12%～35%。PEG转化技术的主要优势在于尽管不同物种的原生质体形成和传代是非常多样的，但该方法均可适用。一般来说，原生质体储存越久，转化效果越差（Penttila et al，1987b），所以原生质体需要现用现制备。此外，原生质体常常不止一个细胞核，这需要做长时间净化处理以得到同核体。

PEG介导的原生质体转化法是通过PEG的介导作用将遗传因子转入受体细胞原生质体中的一种方法，原生质体的制备与再生是转化的关键，此外CaCl2也是不可或缺的成分。目前，多数丝状真菌的转化以原生质体作为感受态细胞，在一定浓度的CaCl2和PEG等条件下和需转化的外源DNA混合完成的。因此，PEG介导的原生质体转化法包括原生质体的制备和原生质体转化两个主要过程。

8111 原生质体的制备与再生

原生质体制备的最大障碍就是细胞壁，木霉菌细胞壁的主要成分为多糖，其次为蛋白质、类脂。多糖主要有几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等。因此，目前主要通过使用纤维素酶、蜗牛酶或溶壁酶等酶法去除细胞壁。具体采用的酶种类、浓度等需要通过具体的实验来确定。影响原生质体制备的因素很多，不同的木霉有其较为适当的形成条件。主要考虑的因素有：①菌龄的选择。菌丝的菌龄对原生质体的产量影响很大，不同菌龄的菌丝在同样的条件下酶解所得到的结果不同，利用合适菌龄的菌丝所得的原生质体明显较多，这与许多霉菌的原生质体分离的情况相似，菌龄过长，菌丝细胞壁发生老化增厚，不易于释放原生质体，菌龄过短则菌丝体易破裂，释放原生质体数量较少，因此，需要针对不同的菌株生长发育情况具体确定合适的菌龄。②破壁酶系统的选择。适当的破壁酶组合是成功地释放原生质体的关键。由于真菌的细胞壁组成复杂，使用单一酶类处理一般效果不理想，所以，通常会采用多个酶的组合配制成复合酶液，并确定相应的酶解时间和酶解温度等相关条件。③渗透压稳定剂对原生质体释放的影响。形成原生质体后，细胞膜失去细胞壁的保护，容易破损，不易保存，而渗透压稳定剂可以维持原生质体细胞膜内外压力恒定和原生质体形状，使原生质体不易破裂且有助于后续试验的进行。因此，渗透压稳定剂是影响原生质体产量的关键因素之一。常用的渗透压稳定剂有山梨醇、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、MgCl2、KCl、NaCl等，例如Penttila等（1987b）在制备Treesei原生质体时使用山梨醇保持渗透压稳定，浓度为12M，浓度为12M的MgSO4也可作为替代的材料。此外，针对某些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al，1989）。针对木霉的原生质体制备有选用无机盐的，例如田媛等（2010）制备康宁木霉（Tkoningii）原生质体时发现无机盐溶液有利于原生质体的释放，而糖醇类不利于原生质体释放。原因可能是无机盐能够促进酶的活性，使酶与细胞能够充分接触。渗透压缓冲液中NaCl最好，KCl次之。而赵乐辉等（2005）在制备木霉T21和T22原生质体时发现蔗糖和甘露醇最合适，所以具体选用什么试剂作为制备原生质体的渗透压稳定剂还需根据具体情况来定夺。

原生质体的再生是进行转化后筛选的关键步骤，每个再生后的原生质体可以成为一个无性生殖体，影响再生的因素很多，主要有：①酶浓度和酶解时间。酶浓度对原生质体再生影响很大，由于使用的破壁酶多数为复合酶，其中会含有对原生质体有害的酶类（例如过氧化物酶、核糖核酸酶等），这些酶必然会影响原生质体的活性。过高的酶浓度使细胞破壁太彻底导致原生质体的细胞膜破裂，使再生率降低。酶解时间对原生质体产量和再生有双重影响。酶解时间短，对原生质体活性影响较小，因而有利于再生，但是原生质体的产量相对低；而延长酶解时间，虽然可以提高原生质体产量，但对原生质体活性影响较大，因而原生质体的再生率明显降低。所以，酶解时间的选定要统筹考虑原生质体的产出率和再生率。②渗透压稳定剂的影响。有些无机盐有利于原生质体的产出，但再生时可能在平板周围形成高盐环境而不利于菌落的形成，而使用糖醇类的渗透压稳定剂由于其对原生质体具有保护作用，还可作为营养利于菌丝生长，所以可能比无机盐更有效。③不同再生培养基对原生质体再生有显著影响。例如黄玉茜等（2005）发现，将制备好的木霉菌T23原生质体分别在基础培养基、完全培养基、改良查氏培养基上再生，结果表明，在基础培养基上再生率最高，平均达到254%，其次为完全培养基，再生率平均为213%，改良查氏培养基的再生效果最差。

再生率＝（高渗溶液稀释所长出的菌落数-用无菌水长出的菌落数）/加入原生质体数×100%

在液体再生培养基中可以观察到原生质体的再生方式，木霉的原生质体通常会在渗透压稳定剂的作用下，液泡吸水而膨大，在体内形成一个或多个大液泡，并向一端伸展，失去圆球形状，并形成不规则的突起，不规则的突起然后类似出芽状长出念珠状畸形萌发管，最后发育成正常菌丝。

8112 原生质体转化

原生质体与外源DNA在包含CaC12的PEG缓冲液中混合，最后将原生质体涂布于再生培养基中选择转化子。其主要原理是PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使细胞接触和粘连；或是通过引起表面电荷紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进入。一般认为，PEG与细胞膜内的水、蛋白质和糖类分子形成氢键，使得原生质体连在一起而发生凝聚，并由于Ca2+的存在而加强，这种细胞间凝聚能够促进DNA的吸收。PEG浓度过高或作用时间过长，易于使原生质脱水破裂，失去再生活性，从而使转化率下降。

为了筛选转化子，转化载体一般需要携带抗性标记基因，按基因编码产物的功能可将这些选择标记分为三大类，即营养缺陷型标记、药物抗性标记和功能产物标记：

（1）营养缺陷型标记：包括一些碳源、氮源和硫源的代谢基因，它们能与相应的营养缺陷型丝状真菌受体菌遗传互补，从而通过营养缺陷筛选出目标转化子，常见的营养缺陷筛选有编码精氨酸生物合成途径中鸟氨酸氨甲酞转移酶的argB+基因和编码尿嘧啶生物合成途径中的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的Pyr4+基因。

（2）药物抗性标记：目前常用的药物抗性标记有编码苯菌灵抗性的bml基因，编码寡霉素抗性的oliC基因；还有来自细菌的潮霉素抗性基因（hygB）、苯并咪唑类杀菌剂抗性基因 BenR、博来霉素抗性基因（ZeoR）、G418 抗性基因（NeoR）、抗硫胺素基因（ptrA）、腐草霉素抗性基因及氨基糖苷类，大环内酯类，金属糖肽类抗生素抗性基因等，其中，潮霉素抗性基因的应用最为广泛。

（3）功能标记：构巢曲霉（Aspergillus nidulans）amds基因编码乙酞胺酶，而黑曲霉菌及许多其他的丝状真菌不能合成此酶，因此，将这些丝状真菌涂布在以乙酞胺为唯一碳源或氮源的选择性培养基上，即可方便地筛选携带amds型质粒的转化子。1995年Thrane等通过PEG介导的原生质体转化方法将来源于大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因转入哈茨木霉（Tharzianum）T3中，木霉菌转化子也可在x-gal平板上呈现蓝色反应或在荧光显微镜下分生孢子梗和分生孢子被观察到绿色荧光的存在，可用于木霉菌的在植物上定殖和在土壤等环境中的分析检测研究。

大多数丝状真菌的转化载体在宿主菌中不能自主复制，而是同源或者异源整合到宿主菌的基因组中。重组效率依赖于多种因素，包括转化的方法和条件、转化的宿主菌、转化的DNA片段与宿主基因组的同源程度及同源序列的长度等。营养缺陷型标记有可能引导载体质粒整合染色体的同源部位，易于筛选，但作为受体的营养缺陷型的筛选比较困难，特别是对一些工业生产菌、病原菌和多倍体菌株几乎难以实现，而药物抗性标记和功能标记则避免了前者的缺点，但带来的环境生物安全问题值得探讨。即使不存在任何选择性压力，转化子在有丝分裂过程中会表现出高度的不稳定性，抗药性筛选容易出现阳性假转化子现象。大多数的丝状真菌转化实验都证明了这一点，尤其对粗糙脉袍菌的转化实验。转化子DNA丢失不稳定的原因可能有部分重复DNA的甲基化、DNA的被切割和DNA重排等。下面提供一种本实验室常用转化木霉方法，仅供参考，具体步骤如下：

（1）原生质制备：取1mL木霉分生孢子悬浮液（1×108孢子/mL）接种到PD中，28℃下振荡培养20h。用4层无菌纱布过滤收集菌丝体，无菌水冲洗5次，016M KCl冲洗至菌丝半透明。向菌丝中加入2mL浓度为10mg/mL的溶菌酶，混匀，30℃下放置3h后用4层纱布过滤，06M KCl冲洗。滤液在5000r/min下离心15min。获得的原生质体用STC［原生质体保存培养基，06M蔗糖、10mmTris-HCl（pH80）、10mmCaCl2］冲洗两遍，悬浮于STC中在4℃下保存。

（2）原生质体再生：先在培养皿底部铺上一薄层OcmBOTTOM培养基（1mol/L蔗糖的CM培养基；OcmTOP培养基：OCM中加入1%琼脂；OcmBottom培养基：OCM中加入15%琼脂），再将原生质体与冷却至40～45℃的再生培养基轻轻混合，倒入上述平板，黑暗培养4～5d，计再生菌落数。原生质体再生率计算：

原生质体再生率＝再生培养基上生长的菌落数（个）∕涂布原生质体数量（个）×100%

（3）原生质体转化：将准备好的质粒5μg加入含有200μL原生质体的50mL离心管中混合均匀，室温下静置20min；加入1mL40%PTC［原生质体再生培养基，1×STC中含40%（W/V）PEG8000］，022μm细菌过滤器过滤除菌到管中，轻轻混匀，室温下静置20min；加入5mL TB3（含50μg/mL 氨苄青霉素），室温、175r/min下摇床培养过夜。

（4）原生质体筛选：将培养过夜的原生质体在3500r/min下离心10min，弃上清液，用剩余大约5mL的残液悬浮沉淀；融化Bottom Agar培养基并冷却到65℃，转移10mL Bottom Agar培养基到含有已复生原生质体的50mL离心管中，加入氨苄青霉素到终浓度50μg/mL，混匀后快速倒入平板；25℃培养10h后，再倒上含有较高浓度潮霉素的Top Agar筛选培养基，25℃下培养2～3d后，挑取平板上的单个菌落，转接含有无抗培养基上培养传代，并经过PCR鉴定和southern blot鉴定确定转化子。

1、混合法

混合法，即将两个词混合或各取一部分紧缩而成一个新词。后半部分表示主体；前半部分表示属性。例如：news broadcast→newscast新闻广播。

2、截成法

特别是在非正式用法中，有时会把某些多音节词缩成一个音节，从而产生截成词。截成法一般可分为以下三种（后两种方法都不大常见）：

a 截去词的尾部：ad = advertisement（广告），demo = demonstration（演示）， expo = exposition（展览会），pro = professional（专业人员）

b 截去词的首部：phone = telephone（电话），plane = airplane（飞机），chute = parachute （降落伞），copter = helicopter（直升机）

c 截去词的首部和尾部：flu = influenza（流感），tec = detective（侦探），fridge = refrigerator （冰箱）

3、混成法

混成法就是把一个词与另一个词“混成一体”来构成合成词的方法。从形态结构看，混成法大致可 分成四类。在现代英语中，很多混成词已经牢固确定，而且已成为新构词很有构词力的样板。

4、缀合法 

英语词缀分为前缀和后缀两种。一般来说，前缀只是改变词的意义，但不改变其词类。后缀不仅改变词的意义，而且使单词由一种词类转变为另一种词类。

5、转化法

转化法就是一个词项不用加后缀就成为或转化为新词类的派生方法。在描述词与词之间的转化时，由于没附加后缀用来作为依据，决定哪个词项应被看作是词根或是派生形式有一定的困难。通常我们把抽象名词和施动者名词看作是派生名词（例如：desire, answer, walk等）。用转化法产生的词主要是名词、形容词和动词。

6、合成法

合成法是把两个或两个以上的词按照一定的次序排列构成新词的方法。 用这种方法构成的新词叫做复合词。下面将复合词分为复合名词、复合形容词和复合动词三个部分加以探讨。

7、复合法

复合名词的主要成分多半由名词表示，次要成分可由各种词类表示。复合名词常见的有六种结构类型，例如名词+名词、形容词+名词、动名词+名词等。

8、缩略法

在英语中，区分三种构词力十分强的缩略方法：首字母拼音法、截成法和混成法。非正式是它们共同的色彩。

9、缀合法

逆成法与下面一节中的缀合法恰好相反，缀合法借用词缀构成新词，而逆成法则去掉被误认的后缀构成新词。例如：televise由television删去-ion逆生而成。利用这种构词手段创造的新词叫做逆生词。逆生词多半属动词，形成逆成词的原形词最多的是名词和形容词。

10、截短法

将单词缩写，词义和词性保持不变的英语构词法称为截短法，主要有截头、去尾、截头去尾等形式。

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混合物的分离和提纯(除杂)

1 分离与提纯的基本原理

(1)分离：就是用物理或化学的方法将混合物巾的各组分分开，并将物质恢复到原状态。

(2)提纯和除杂：用物理或化学的方法把混合物中的杂质除去而得到纯物质。在提纯过程中，如果杂质发生了化学变化，不必恢复成原物质。二者的方法在很多情况下是相似的，但分离比提纯的步骤要多，因为各组分均要保留，绎过化学反应使混合物中各组分经转化而分离后还要复原为原来的组分物质提纯和除杂过程中经常用到分离操作，二者有时又密不可分。

2．分离和提纯应遵循的原则

(1)不能“玉石俱焚”：即试剂一般要求与杂质反应，不与要保留的物质反应。但在特殊情况下，所加试剂可和保留物质应应，但最终要转化成需要保留的物质如除去FeCl3，溶液中的NaCl，可加过量的NaOH溶液→过滤→洗涤→加适量稀盐酸。

(2)“不增““不减”：即不增加新的杂质，不减少要保留的物质如除去FeCl3中的少量Fe2(SO4)3应选用BaCl2而不应选用Ba(NO3)2，否则发生反应3Ba(NO3)2+Fe2(SO4)3==3BaSO4↓+2Fe(NO3)3溶液中又增加了Fe(NO3)3

(3)易分离：反应后，物质的状态不同，便于分离。

(4)不污染环境：即耍求所选用的除杂方法不能产生可污染环境的物质。

(5)不能“旧貌变新颜”：即除杂结束前，要恢复保留物质的原有状态。

常见除杂的方法：

CO2(O2)：将气体通过灼热的铜网

CO2(H2或CO)：将气体通过灼热的氧化铜

O2或CO2或H2(含H2O)：将气体通过浓硫酸或氧化钙或氯化钙等干燥剂

O2或H2或CO(含CO2或SO2)：将气体通入氢氧化钠溶液中

Cu(含Fe或Mg或Zn)：加入足量的稀盐酸或稀硫酸，过滤

Fe(含Cu)：用磁铁将铁粉吸引出来

Cu(含CuO)，Fe(含Fe2O3)：高温下与H2或CO反应

CuO(含Cu或C)：在空气中灼烧

CaO(含CaCO3)：高温煅烧(CaCO3分解成CaO和CO2)

CaCO3(含CaO)：加足量水溶解，过滤，取滤渣

Ca(OH)2(含CaO)加足量水

FeSO4溶液(含H2SO4或CuSO4)，FeCl2溶液(含盐酸或CuCl2)：加过量铁粉，过滤，取滤液

NaCl溶液(含Na2CO3)：加适量稀盐酸

Na2SO4溶液(含CuSO4)：加适量 NaOH 溶液

酸、碱、盐溶液的除杂技巧：

1．被提纯物与杂质所含阳离子相同时，选取与杂质中的阴离子不共存的阳离子，再与被提纯物中的阴离子组合出除杂试剂。如除去Na2SO4溶液中的NaOH：可选用稀H2SO4溶液为除杂试剂(2NaOH+ H2SO4==Na2SO4+2H2O)、除去KCl溶液中的 K2SO4：可选用BaCl2溶液为除杂试制(K2SO4+BaCl2==2KCl+BaSO4↓，过滤除去)

2．被提纯物与杂质所含阴离子相同时，选取与杂质中阳离子不共存的阴离子，再与被提纯物中的阳离子组合出除杂试剂，如除去NaCl溶液中的BaCl2：可选用 Na2SO4溶液为除杂试剂(BaCl2+Na2SO4=BaSO4↓ +2NaCl，过滤除去)再如除去KNO3溶液中的AgNO3：可选用KCl溶液为除杂试剂(AgNO3+KCl=AgCl↓ +KNO3，过滤除去)。

3．被提纯物质与杂质所含阴离子、阳离子都不相同时，应选取与杂质中阴、阳离子都不共存的阳、阴离子组合出除杂试剂。如：除去NaCl溶液中的CuSO4：可选用Ba(OH)2溶液为除杂试剂[CuSO4+Ba(OH)2= BaSO4↓+Cu(OH)2↓，过滤除去]。

分离和提纯的方法：

物质的分离和提纯有两种主要的方法，即物理方法和化学方法。实际上在实验过程中往往需通过综合法来进行。

（1）物理方法主要包括过滤，蒸馏，结晶

方法 适用范围 举例 注意事项

过滤 分离不溶性固体和液体 粗盐提纯 ①过滤时要“一贴、二低，三靠”；

②必要时要洗涤沉淀物

结晶 利用混合物中各组分在某种溶剂中溶解度随温度变化不同的性质来分离提纯物质 分离氯化钠和硝酸钾混合物 ①一般先配较高温度下的浓溶液，然后降温结晶：

②结晶后过滤，分离出晶体

蒸馏 沸点不同的液体混合物 石油的分馏 ①温度计水银球在蒸馏烧瓶的支管口处；

②加沸石(或碎瓷片)；

③冷凝管水流方向

（2）化学方法

除杂方法 除杂原理 应用实例

化气法 与杂质反应生成气体而除去 除Na2SO4中的NaCO3，可加适量稀盐酸

NaCO3+H2SO4==Na2SO4+CO2↑+H2O

沉淀法 将杂质转化为沉淀过滤除去 除去NaCl中的Na2SO4可加适量的BaCl2

Na2SO4+BaCl2==BaSO4↓+2NaCl

置换法 将杂质通过置换反应而除去 c除去FeSO4中的CuSO4可加过量的铁粉

CuSO4+Fe==Cu+FeSO4

溶解法 将杂质溶丁某种试剂而除去 除C粉中的CuO粉末，可加适量稀盐酸，再过滤

CuO+H2SO4==CuSO4+H2O

加热法 杂质受热易分解，通过加热将杂质除去 除CaO中的CaCO3可加热

CaCO3CaO+CO2↑

转化法 将杂质通过化学反应转化为主要成分 除去CO2中的CO，可将气体通过灼热的CuO

CO+CuOCu+CO2

（3）综合法

在进行混合物的分离或提纯时，采用一种方法往往不能达到目的，而要采用几种方法才能完成，这就是综合法。综合法主要有三种：

①物理方法的综合：主要是溶解、过滤、蒸发、结晶等方法的结合：

②化学方法的综合：当某物质所含杂质不止一种时，通常需加入多种试剂除去(或分离)不同的物质。

③物理与化学方法的综合：当某物质所含杂质不止一种，且有能用物理方法除去(或分离)的杂质时，首先应考虑用物理方法除去一种或几种杂质，然后再用化学方法除去其余杂质。

(4)除杂方法的几个优化原则

①若同时有多种方法能除去杂质，要选择那些简单易行、除杂彻底的方法。

②应尽量选择既可除去杂质，又可增加保留物质的方法，即“一举两得”。

③先考虑物理方法，再用化学方法。

常见的混合物类型及分类与提纯的方法见下表：

混合物类型\采用的方法 物理方法 化学方法

固—固混合 可溶—可溶 结晶 把杂质变成沉淀、气体等除去

可溶—不溶 过滤 ——

不溶—不溶 — 把杂质变成可溶物除去

固—液混合 过滤 ——

液—液混合 —— 把杂质变成沉淀，气体或被提纯物

气—气混合 —— 把杂质变成固体、溶液或被提纯物