什么是3D液滴熔融技术?

悬浮液滴是一种油性液滴长期稳定悬浮在水相之中的微乳液，其中油相可包含各种油性成分，可广泛应用于新型材料加工，开发新产品应用于化妆品、医药、食品等领域。传统通过剪切方法制备的悬浮液滴体系，存在多个问题。首先通过剪切方法制备的体系，无法对分散过程进行准确控制，易形成相分离，导致油相在水相中的比例较低，难以提高。其次通过剪切方法制备的体系，其液滴粒径不一、分散不均、位置无序，限制其在开发新材料和设计新产品中的应用，本发明采用3D液滴打印技术，能够对液滴大小和位置进行精准控制，制备特定结构的悬浮液滴体系，对材料和产品进行精准设计，增强功能可视化效果，扩大其应用范围。

在本发明中利用一种以数字模型文件为基础，通过逐层打印的方式来构造物体的熔融沉积式3D打印技术。3D打印技术可以将复杂的三维模型转化为一系列简单的二维制造，因而可以在不用模具的情况下可以生成任意复杂的模型。

本发明把传统熔融沉积式3D打印机的耗材进给机构改造为控制液体流量的压力控制机构，如注射泵或者蠕动泵，将液体通过打印喷头在水凝胶中打印出粒径均一的液滴。与通过剪切方法制备悬浮液滴相比，3D打印机制备悬浮微液滴能精确控制油性液滴在三维空间的位置，通过油性液滴的特定排列优化油相和水相的比例，另外控制每个液滴在三维空间位置可以打印出特定形状的三维模型，拓展了该技术在各个领域中的应用。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于3D打印技术制备悬浮液滴的方法，解决了传统的以微流控技术制备悬浮液滴难以提高油相占比的难题，该方法简便易行并可获得大小均一、位置可控的液滴，并可根据具体需求制备由液滴组成的特定形状的三维模型，该技术在化妆品、工艺品等领域中具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明提供如下解决方案：

本发明首先公开了一种制备悬浮液滴的3D打印机，包括三维移动打印系统，所述的三维移动打印系统包括Z轴升降平台、X轴移动机构、Y轴移动机构和打印喷头，X轴移动机构、Y轴移动机构用于带动所述打印喷头实现XY平面内的移动；所述的Z轴升降平台用于实现待打印区域与打印喷头之间Z轴方向距离的调节；所述的3D打印机还包括压力控制机构和导管；所述的压力控制机构通过导管与打印喷头相连。

本发明以水平面为XY平面，Z方向为垂直与所述水平面的方向，且以水平向右为X轴正方向，水平向前为Y轴正方向，竖直向上为Z轴正方向。

优选的，所述的压力控制机构为注射泵或蠕动泵。

优选的，所述的3D打印机还包括用于容纳水相的箱体；所述的箱体设置在Z轴升降平台，由Z轴升降平台调节所述箱体在Z轴方向的高度；所述箱体位于打印喷头下方。

本发明还公开了一种所述3D打印机的悬浮液滴制备方法，包括以下步骤：

1)将具有剪切变稀的材料溶解到水中，得到透明的水凝胶状液体作为水相，选取一种或多种油性物质混合作为油相；

2)将水相放置在Z轴升降平台上，压力控制机构用于提供动力将油相通过打印喷头挤出；

3)通过X轴移动机构、Y轴移动机构带动打印喷头在XY平面内的移动，通过Z轴升降平台实现待打印区域与打印喷头之间Z轴方向距离的调节，从而控制3D打印机上的打印喷头的运动轨迹，控制压力控制机构的工作状态，从而剪切油相得到分散到水相中的液滴。

优选的，所述的剪切变稀材料可以为卡波姆或黄原胶。

优选的，所述的打印喷头是一个细长型的空心圆柱，一端与导管相连，另一端作为喷嘴。

优选的，所述的打印喷头运动轨迹是打印喷头移动到水相中一个位置时先停顿，然后压力控制机构挤出定量的油相体积，等待定量的油相体积全部挤出后再移动到下一个位置。

优选的，所述的油性物质可以为蚕丝油、羊绒酯或维生素E中的一种或者几种混合。

本发明还公开了通过控制打印喷头的移动轨迹得到由微液滴组成的特定形状的三维模型。

本发明还公开了根据所述的3D液滴打印机及其制备悬浮液滴，所述的液滴可以被精确控制其粒径大小和空间位置，采用特定的液滴空间排布方式可以最大优化水相和油相的配比。另外采用以数字模型文件为基础3D打印技术，可以根据需求制备出由液滴组成的特定形状的三维模型。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提出一种基于3D液滴打印机制备悬浮微液滴体系，该方法简便易行，微液滴粒径均一可控，可对体系进行精准设计和控制。

(2)本发明采用3D打印技术，是以数字模型文件为基础，可以根据需求制备出由液滴组成的具有特定三维形状的悬浮微液滴体系。传统通过剪切方法制备的体系，其液滴粒径不一、分散不均、位置无序、易形成相分离。3D液滴打印技术能够对液滴大小和位置进行精准控制，制备特定结构的悬浮液滴体系，在实际生产中具有广泛的应用前景。

(3)传统通过剪切方法制备的体系，无法对分散过程进行准确控制，易形成相分离，导致油相在水相中的比例较低，难以提高。本发明提出3D打印制备悬浮微液滴体系，通过精确控制每个液滴位置实现液滴的最优排列，可大幅度提高油相在悬浮微液滴体系中的比例，最高可达74％。

(4)本发明采用3D液滴打印可以精准控制微液滴大小，优化油相与水相的比例，打印出由油相液滴组成的具有特定形状的三维模型。通过选取相应油相可以开发和设计相应材料产品，例如采用蚕丝油等对皮肤有益的油相，可开发和设计功能可视化的化妆品。再例如采用可聚合油相单体，通过3D液滴打印设计密堆积结构，将油相单体聚合形成颗粒，颗粒间相互连接，可得到由颗粒组成的材料模型。

附图说明

图1为利用改装后的3D打印机制备悬浮微液滴。

图2为制备由悬浮微液滴组成的以简单立方排列的液滴模型。

图中：1、注射泵，2、导管，3、打印喷头，4、步进电机，5、容器，6、水相溶液、7串行接口线。

图3为制备有悬浮微液滴组成的球形和倒映四角锥型的液滴模型。

具体实施方式

参照附图1，采用本发明的方法制备步骤如下：

下面结合附图1和实施例对本发明做进一步说明。

本发明提供了一种3D打印机及其在水凝胶中制备悬浮液滴的方法，通过3D打印机来控制液滴的粒径大小和空间位置，如图1所示，该3D打印机由注射泵1、导管2、打印喷头3、步进电机4、容器5组成。3D打印是一种以数字模型文件为基础的技术，通过数字模型文件可以控制打印机三维运动系统和注射泵的推进量。将打印喷头浸没到水凝胶中。打印喷头移动到某个位置时，停顿几秒，然后注射泵进给定量的油相体积，油相在打印喷头处形成微球，等待定量油相全部被挤出，然后再移动打印喷头，在剪切力的作用下，得到悬浮在水凝胶中的液滴。

下面举实施例说明本发明，但本发明并不限于下述的实施例。

实施例1：制备由液滴组成的圆柱体。

采用本发明的方法制备悬浮液滴，具体步骤如下：

(1)将传统的熔融沉积式3D打印机的控制耗材进给的电路通过串行接口连接到注射泵控制系统上。选取内径为033mm、外径063mm、长度为15mm的针头作为打印喷头，打印喷头与注射泵通过PE管连接输送油相液体。

(2)将卡波姆940溶解到水中，调节pH到7。得到澄清的水凝胶作为水相。选用异壬酸异壬酯作为油相。

(3)用菌种瓶盛放水相，然后将菌种瓶放置在Z轴平台上。

(4)通过编写数字模型文件控制3D打印机工作进程，得到由油相液滴组成的三维圆柱体模型。

实施例2：制备由液滴组成的具有特定三维形状的悬浮微液滴体系。

(1)如实施例1所示，搭建3D液滴打印机，准备油相和水相材料，将水相放入烧杯中，然后将烧杯放置在Z轴平台上。

(2)通过编写数字模型文件控制3D打印机工作进程，得到由油相液滴组成的三维球形模型和倒映四角锥模型(如图3所示)。

蓝海大脑生命科学冷冻电镜工作站研究人员表示：

单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特定细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、RNA 提取、逆转录、文库构建和测序，便可利用数据分析获得多个细胞的基因表达谱。

1单细胞测序与普通转录组测序的区别

普通转录组使用细胞混合物组成的样品进行测序，因此只能估计基因在细胞群中的平均表达水平，没有考虑样本中各个细胞的基因表达的异质性。无法分析早期发育组织或复杂组织的异质系统（如大脑组织等）。为克服这一限制，开发了单细胞水平的转录组测序技术（scRNA-seq）。

2单细胞测序的原理

单细胞测序技术以单个细胞作为对象，通过对单个细胞遗传物质均匀扩增，标记建库后进行测序，最后对单个细胞基因组或转录组展开数据分析，其技术原理主要包括单细胞分离、扩增测序和数据分析3方面。

单细胞分离：主要包括荧光激活细胞分选法( flow- activated cell sorting ，FACS) 以及微流控分选法( microfluidics) 等。市场上，较成熟的商业单细胞测序公司主要有 10X Genomis 公司 的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。

3' 端文库的构建

通过10×genomics仪器将单个细胞与单个凝胶微珠通过油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下来把细胞膜破掉，让细胞当中的mRNA游离出来。游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，也就是和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接触。接着，发生逆转录反应。mRNA与凝胶微珠上带标签的DNA分子相结合，在逆转录酶的作用下，逆转录出cDNA来。

scRNA-seq 非常适合研究细胞群的异质性。例如，识别组织的细胞类型，定义不同细胞类型的"转录指纹"，研究细胞分化，探索疾病或环境因素导致的细胞组成变化等。

单细胞测序的经典流程：分离单细胞（核），将RNA转换为cDNA，准备测序文库（illumina）后测序。

SMART-seq2是一种低通量单细胞测序法，提供全长转录组的定量，适合研究小细胞组（如差异isoform使用，低表达转录本的特征）。

10x Chromium是一种高通量方法，使用UMIs进行定量，适合研究高度异质组织和大量的细胞样本。

电脑数据需要缓冲。

10X Genomics与其他测序技术的主要区别在于其barcode和建库的操作。虽然上样之后都是自动化操作，但了解其建库原理对后续的生物信息学分析也是有必要的。

10X Genomics运用微流控系统进行细胞分选，带有Barcode的Gel Beads 匀速地从左方进入，待分选的细胞和酶从下方以一定时间间隔进入，并与Gel Beads结合，进入油相中形成GEMs。

提到纳米科技的应用，人们通常会想到一些高精尖领域。事实上，纳米科技还与人们的日常生活息息相关。

　　工作人员在内蒙古巴林右旗牧区现场调试纳米净水器

　　5年前，中国科学院推出了“变革性纳米产业制造技术聚焦”战略性先导科技专项（以下简称纳米专项），支持科学家将实验室小试技术推向中试，让更多的纳米科技成果走向实际应用。如今该专项已取得显著成效。日前，中科院宣布，经过5年协同攻关，纳米专项形成了一系列纳米核心技术创新，其中有不少技术已成功应用于健康诊疗、饮用水处理以及绿色印刷等与百姓生活密切相关的领域。

　　1、可用于健康诊疗

　　在癌症的早期检测、预后判断和靶向治疗伴随诊断方面，纳米专项研发的“肿瘤捕手”技术灵敏度高

　　纳米的名称起源于希腊语，意思是“矮小的”。实际上，纳米和我们所熟悉的米、毫米和微米一样都是长度计量单位。

　　“1纳米等于10的负9次方米，也就是1米的十亿分之一，比单个细菌的长度还要小，肉眼是看不见的”，纳米专项首席科学家王琛研究员说，“纳米本身仅是计量长度而已，真正有价值的是纳米科技，它是研究结构尺寸在1纳米至100纳米范围内材料的性质和应用的一门科学技术。”

　　研究这么小尺寸的材料用来做什么呢？

　　王琛进一步解释说：“其实，许多生命体中存在特殊的微米—纳米结构，这样排布的结构会产生许多优异的性能，我们可以利用这种优异性便利我们的生活。”

　　纳米科技作为上世纪末开始兴起的新兴学科，在我国得到高度重视。《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006—2020年）》中，就将纳米科技作为我国“有望实现跨越式发展的领域之一”。中科院重大科技任务局副局长齐涛说：“可以说，在纳米科技领域，我国是与国外同步布局的。”

　　得益于国家的高度重视和大力投入，纳米科技在我国的发展不断加速。一项数据表明，1997年，与纳米相关的SCI（科学引文索引）论文中，只有6%涉及我国作者，但从2011年开始，我国相关作者数量已居世界首位。与此同时，纳米科技也逐渐开始渗透到人们生活的诸多方面，并发挥着越来越大的作用。

　　1996年，科研人员在实验中发现，DNA修饰的金纳米颗粒溶液可以根据温度的变化在蓝红两种颜色之间转换，从此开始了新一代医学诊断、治疗技术的研究。

　　此后的研究结果进一步表明，纳米科技在重大疾病的诊断和治疗方面显示出很多优势，应用开发潜力巨大。例如，纳米科技可以用来做微量标志物的检测，使疾病能获得早期诊断；研发的纳米材料可以对疾病进行靶向治疗，让医学诊断和治疗向更精准的方向前进等。

　　在体外诊断方面，纳米专项成功研发出了多项体外诊断关键技术。其中，纳米微流控免疫芯片体外诊断技术将纳米技术与微流控技术相结合，可用于对多项指标进行联合检测，目前有多款产品获得了国家医疗器械注册证书。

　　国家纳米科学中心高级工程师沈海滢介绍说：“这项技术中的炎症纳米微流控免疫检测芯片，能够快速区分细菌性感染和病毒性感染，判断感染所处的阶段，为科学、有效使用抗生素提供依据，可以在很大程度上避免抗生素滥用。”

　　在癌症的早期检测、预后判断和靶向治疗伴随诊断方面，纳米专项研发的“肿瘤捕手”技术灵敏度高，临床前研究效果显著。

　　据国家纳米科学中心杨延莲研究员介绍，除少数癌症外，绝大多数恶性肿瘤出现在人体的上皮组织细胞，从肿瘤组织脱落的上皮细胞进入外周血循环成为循环肿瘤细胞，是肿瘤检测的重要生物标志物。这些细胞的特点是血液中含量极低且微小，而“肿瘤捕手”的核心技术就是运用多肽纳米磁珠技术捕获这些肿瘤细胞，实现高效捕获、识别以及对肿瘤表面标志物分子的精准检测，从而实现早期检测、疗效预测和动态检测。该技术目前已经实现技术转让和产业化落地。

　　在药物研发方面，纳米专项完成了多项纳米药物制剂的初期研发工作，部分样品已进入临床审批环节。其中1个纳米新药环胞素眼用乳剂现已完成临床试验，多个针对肿瘤类重大恶性疾病的纳米制剂获得临床批件。

　　2、可用于饮用水处理

　　纳米材料在氟、砷、重金属离子及微量有机污染物等的去除方面具有优势

　　在传统的饮用水处理方式下，部分低浓度、高毒性有机或无机微污染物会有明显残留，长期饮用会对人体造成严重伤害。因此，饮用水中微污染物的处理是饮用水安全领域最富有挑战性的前沿课题之一。富有活力的纳米材料具备常规材料无法比拟的高吸附及催化效率等优势，为解决这些难题提供了新的方法。

　　生活在内蒙古部分牧区的牧民，祖祖辈辈一直深受饮用水污染之害。“过去，这些牧民饮用水来源主要是未经处理的地下水。然而，这些牧区地下水中普遍存在着氟、砷、微量有机物、细菌等污染物超标的问题，导致地方病发生。”王琛说。

　　水质问题已经成为当地牧民区域性贫困及因病致贫、返贫的重要因素之一。面对这种状况，当地政府和群众都十分着急。直到纳米专项的介入，情况有了转机。

　　“纳米材料在氟、砷、重金属离子及微量有机污染物等的去除方面具有优势。”王琛说，纳米专项针对牧民分散的居住条件及饮用水污染状况，研发了分散式的饮用水净化系统，净化后水质全部达到国家城市饮用水标准。

　　在使用方面，这种纳米净水系统的成本很低。“只需要一年换1—2次核心滤芯，就能长效、经济地保障牧民的饮水安全。”王琛说。

　　据介绍，在纳米专项帮助下，截至2017年底，已有1200户牧民受益于纳米净水技术，喝上了干净安全的饮用水。

　　3、可用于绿色印刷

　　实现印刷产业的绿色化、功能化、立体化和器件化

　　不用感光冲洗，也不产生废水废液，报纸、书籍的版样就可以打印出来；电脑、手机的线路板不用刻蚀，同样也可以轻松打印出来……这些看似“不可能完成的难题”已被纳米绿色印刷技术攻克。

　　纳米绿色印刷的核心理念就是将纳米材料和印刷技术相结合，实现印刷产业的绿色化、功能化、立体化和器件化。

　　在纳米绿色印刷方面，纳米专项的成就十分显著。研究人员突破国际上通行的感光制版技术思路，研发了纳米绿色印刷制版技术，并形成了包括“绿色版材、绿色制版、绿色油墨”在内的完整的绿色印刷产业链技术。

　　中国科学院化学研究所研究员宋延林介绍说，传统印刷制版的原理是感光成像、化学显影，而纳米绿色印刷制版技术是利用纳米材料制作出特殊的版材和墨水，“打印时可使印版表面呈现出亲水的空白区和亲墨的图文区，这样就可以直接印刷了。”

　　纳米专项绿色制版、绿色版基与绿色油墨技术的突破，彻底解决了传统印刷产业中制版曝光冲洗、版基电解氧化和油墨毒害溶剂VOC的排放，并具备环保和成本方面的优势。

　　“传统印刷制版技术是基于曝光成像原理，采用曝光、显影、冲洗的技术路线，需要暗室操作、工艺繁琐，从而造成大量材料浪费和废液排放”，宋延林说，“而纳米绿色印刷技术用纳米涂层取代原来电解氧化的过程，用纳米材料打印制版代替曝光成像，用水性墨代替溶剂性墨，可从源头上解决印刷产业链中80%以上的污染。”

　据测算，纳米绿色印刷技术全面推广以后，全国每年可减排上万吨有机溶剂、数百万吨废液废水，节约数百吨银和数万吨铜等金属。

关于浸润与不浸润原理，相关内容如下：

浸润与不浸润原理是液体在固体表面上的吸附性质，由于液体与固体之间的相互作用力不同，导致液体在固体表面上有浸润和不浸润的现象。下面我将分段详细介绍浸润与不浸润的原理及其相关知识。

1浸润与不浸润的概念和定义

浸润是指液体在固体表面上的自由表面呈现凹形曲面的现象，而不浸润则是指液体在固体表面上的自由表面呈现凸形曲面的现象。具体来说，浸润的液体与固体的相互作用力大于液体分子间的相互作用力，而不浸润的液体与固体的相互作用力小于液体分子间的相互作用力。

2浸润与不浸润的影响因素

液体在固体表面上的浸润和不浸润现象，受到多种因素的影响。其中最为重要的因素是液体与固体之间的表面张力差异，也就是接触角。当接触角小于90度时，液体浸润；

当接触角大于90度时，液体不浸润。此外，液体的黏度、表面张力、溶解度以及固体表面的物理化学性质等都会对浸润和不浸润产生影响。

3浸润与不浸润在实际应用中的作用

浸润与不浸润在实际应用中起着重要的作用。例如，在印刷行业中，墨水的浸润性决定了其在纸张上的扩散和分散情况，从而决定了印刷品的质量和效果；在涂料工业中，涂料的浸润性决定了其在基材上的附着力和覆盖面积，从而影响了涂层的稳定性和耐久性。

4浸润与不浸润的应用范围

浸润和不浸润原理在很多领域都有广泛的应用。例如，在构建微流控芯片和生物芯片时，浸润与不浸润原理可以用来控制液体在微通道内的传输和混合；

在表面润湿处理、防水处理和液晶显示技术中，也都需要利用浸润和不浸润现象。此外，浸润与不浸润原理还在油田勘探、湖泊生态学等许多领域有着重要的应用价值。

总之，浸润与不浸润原理是液体在固体表面上吸附性质的基本规律，涉及到接触角、表面张力等因素。在实际应用中，浸润和不浸润原理广泛应用于各种领域，发挥了重要作用。

PDMS（polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷）在室温下是一种无色、粘稠的液体，因此被称为硅油，是软光刻工艺中常用的聚合物。PDMS是一种廉价、安全和无毒的聚合物，具有良好的透光性和高化学惰性。它是一种具有低杨氏模量的高等级弹性体。由于PDMS既不粘附在AZ4620上，也不粘附在晶圆上，我们在实验中利用PDMS的优良特性，将平面微透镜阵列结构反转并转移到PDMS上，产生一个柔性图案。

倒模工艺开始之前，必须准备好PDMS溶液。由于PDMS在室温下不能固化，所以要添加特定的固化剂。PDMS溶液是通过将PDMS预聚物和固化剂以10:1的质量比混合制备的。在充分搅拌后，混合物中出现大量的气泡，并在真空桶中抽空（也可放置40分钟以上），直到混合气体完全被抽走。然后将先前准备好的平面微透镜阵列模板连接到离心机上，将少量的PDMS溶液慢慢倒在微透镜阵列上，让其慢慢散开并去除任何气泡，相应调整离心机的速度和时间。为了获得厚度均匀的PDMS网板（使用较厚的PDMS网板是为了防止在随后的负压过程中薄膜下垂），这里再次使用了多次旋涂的方式。在涂抹单层后，让薄膜静止约1分钟，然后进行软烘，在加热前寻找气泡，如果气泡没有完全排出，在加热过程中就会形成气泡。一旦旋涂过程完成，薄膜就在65℃的烘箱中烘烤2小时。最后去除薄膜，得到一个厚度约为450微米的柔性PDMS模板，其凹陷的微透镜阵列与微透镜阵列的形状相反

首先依次组装主体和可拆卸式盖子，然后将模具安装在防震台上。然后将柔性PDMS阴性膜连接到加工成顶盖的球状缺陷的顶部，然后放置并连接微流注射腔室。连接一个真空泵进行抽气，此时，柔性PDMS模板在负压下下沉，并与盖子紧密贴合，形成我们需要的弧度。这里的微孔阵列设计允许在PDMS网板上施加更均匀的力，使负压均匀地分布在网板上，并使薄膜拉伸的各向异性降到最低。负压稳定后，毛细管与微流控注射泵（LSP04-1A，朗格恒流泵有限公司）连接，进行粘合。通过微流控注射室的粘合孔和通气孔固定一定量的过量，以有效清除可能存在的空气和杂质。最后，整个装置被置于紫外线设备下，一旦模塑材料固化，它就被脱模，以获得弯曲的微透镜阵列。

设计中选择的成型材料是NOA81（Norland Optical Adhesive 81，Norland Products Inc），它具有优良的光学透光性，在可见光波长中保持90%以上的透光率，并且具有高度的耐溶剂性，完全固化后硬度不脆。由于其弹性，该结构能够缓解由振动或环境温度的极端变化引起的应力，从而确保固化的复眼结构的长期性能。此外，在紫外光下的固化速度极快，最快的紫外固化在几十秒内完成，这对保护紫外光刻设备非常重要。

用于单细胞测序的细胞条码化的制作方法

admin 2022-06-16 06:16:13 8次

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。 

用于单细胞测序的细胞条码化

1相关申请的交叉引用

2本技术要求2019年11月4日提交的，题为“用于单细胞测序的细胞条码化”的第62/930,288号美国临时专利申请的优先权，其全文通过引用纳入本文，用于所有目的。

3发明背景

4目前的液滴微流体方法实现了数千细胞的通量。然而，更大的数量可能难以实现。使用微流体技术，至少有三个导致细胞悬浮液死体积和因此用于分析的细胞丢失的因素：1)微流体装置的入口处的剩余液体2)微流体通道预划分中的剩余液体和3)未从微流体装置的出口处收集的材料。此外，非常大的液滴乳化体积，对应于高细胞通量实验，很难以及时的方式产生，由于所需的体积。这可能对于细胞活力和细胞内含有的不稳定的核酸底物(如rna)有不利影响。最后，当产生较大的液滴乳液时，其增加的体积使其难以将单个乳液装载入与热循环仪兼容的单管中，从而进一步限制了大乳液体积的实施。

5单细胞条码化平台需要昂贵的微流体技术(芯片、油和仪器)和条形码珠。仪器还需要昂贵的现场服务工程师来维护和解决硬件问题。

6虽然液滴微流体技术改进了可扩展性，除非使用更复杂的芯片上(on-chip)液滴合并和皮注射(picoinjection)功能，否则只支持添加一种溶液。

7用寡核苷酸直接标记细胞是使用寡聚物-偶联珠的选择。然而，在不破坏细胞生理的情况下，装载到细胞上的寡核苷酸的最大数量约为100-1000万。在nl大小的液滴中，寡核苷酸的终浓度往往将不足以驱动分子生物学反应，因此阻止液滴与直接寡核苷酸标记的细胞兼容。

8发明概述

9高密度寡核苷酸，范围达到106至107个分子，可以通过各种方法附接至细胞。例如，可以通过细胞特异性寡核苷酸偶联抗体(stoeckius等2018，genome biology)或通过脂质修饰的寡核苷酸(mcginnis等2019，nature methods)标记细胞。寡核苷酸细胞附接创造了直接在细胞上构建细胞条形码的可能性，例如，通过拆分汇集条形码构建(fan等2015，science)。这些细胞条形码反过来可以用于条码化靶向的细胞的核酸底物。

10以前，这种形式的细胞条码化的一个要求是，在寡核苷酸裂解或从细胞释放之前，细胞与附接细胞条形码寡核苷酸的互补物必须被共同限制在分区中，此时可以发生与细胞核酸底物的附接。虽然液滴提供划分格式用于这种类型的反应，但是存在一些缺点。首先，单个乳液中液滴的数量上限是约100-200万。为了尽量减少多个细胞共同定位于单个液滴中，可以以大约005-01的λ装载细胞。基于每个乳液的液滴数量，封装的细胞的数量被限制在最大50,000至100,000。这种细胞通量对于某些类型的实验可能是不足够的，且受到向上可扩展性的限制。第二，由于入口处、微流体和液滴中剩余的细胞悬浮液不能从出口处收获，使用液滴微流体技术的细胞损失很难消除，导致细胞利用率为约60-85％。对于珍贵的细胞，这种水平的细胞利用率可能是不足够的。第三，液滴微流体技术需要芯片、油和仪器，都昂贵且难以支持。第四，在已经形成的液滴中加入试剂并在保持液滴的同时洗涤产物，虽然通过皮注射、液滴合并和磁珠捕获方法是可行的，但不容易工程化。这种限制使得单细胞

dna分析困难，因为简单的液滴微流体技术不支持蛋白酶k消化、随后失活然后加入生物化学品。第五，因为只有100-1000万寡核苷酸可以在不破坏膜的情况下被装载到细胞上，液滴必须有几十pl的体积，以提供足够的寡聚物浓度以驱动分子生物学反应。这些小液滴可能很难通过两个水性入口的微流体技术实现。第六，在进行条码化反应之前，细胞通常必须被清洗以除去其培养基。这明显增加了细胞损失。

11本方法用液滴解决了上述限制，如下：在细胞上建立细胞条形码后，用与细胞密度匹配的水凝胶溶液重悬细胞，使得细胞不沉降。这可以通过用于保持细胞悬浮的常用试剂实现，例如蔗糖缓冲、percoll(西格玛(sigma))和/或optiprep(西格玛)。然后接着发生水凝胶的固化(solidification)。固化背后的机制取决于用于水凝胶的材料。例如，琼脂糖的固化会由温度下降引起。或者，藻酸盐可以使用钙交联。或者，temed启动了聚丙烯酰胺单体的交联。因此，细胞被分散在整个固化的水凝胶基质中。

12水凝胶可以经或不经修饰以结合细胞条形码寡核苷酸。例如，细胞条形码寡核苷酸可以在5’端用生物素修饰，亲和素类似物(例如链霉亲和素)可以被偶联至水凝胶材料。因此，当在溶液中时，带有结合的寡核苷酸的细胞将自由移动，然而，一旦水凝胶固化，任何释放的寡核苷酸将在细胞膜的直接的附近结合至基质，在细胞膜存在的地方形成壳或皮。例如，001至10％重量/体积(wt/vol)的水凝胶对离子和非离子去污剂、以及低分子量蛋白质、酶和辅因子是多孔的。因此，在将细胞捕获在水凝胶基质中之后，细胞裂解剂(例如01％np-40)可以被应用于细胞。裂解剂将通过基质扩散并裂解细胞。细胞条形码寡核苷酸裂解或释放将作为细胞裂解和膜溶解的直接结果发生，或通过特异性或非特异性试剂从细胞裂解或释放寡核苷酸。然后释放的细胞底物核酸将结合至细胞条形码寡核苷酸，其已经被固定在细胞膜/水凝胶界面的壳中。

13通过细胞/水凝胶界面圈起来的区域的体积基本上是细胞的体积。无论细胞条形码寡核苷酸是否被固定在寡核苷酸的壳上，这种最小体积将显著增加细胞条形码寡核苷酸的有效浓度，达到最大值。这可以补偿，例如，对于在不影响细胞生理的情况下可以被装载到细胞上的细胞条形码寡核苷酸数量有限，例如，每个细胞100-1000万寡核苷酸。对于直径约为9微米的细胞，用200万寡核苷酸的有效浓度将是几百个nm，其为足以支持大多数分子生物学反应(例如逆转录)的浓度。低分子量rna或dna依赖性聚合酶可以与裂解剂一起或之后加入，也可以在中间的洗涤之后加入，以除去或灭活细胞裂解剂。

14一旦细胞底物核酸加细胞条形码寡核苷酸标签，导致细胞条码化发生，在从固化或未固化的水凝胶基质除去材料之后，文库制备的最后步骤可以在水凝胶基质中或溶液中发生。例如，逆转录酶，由于其低分子量，将流经组合物中高达5％的水凝胶。将其与裂解剂一起，或是与或不与寡核苷酸裂解/释放剂一起应用，将导致以下事件。随着裂解剂溶解细胞膜，细胞条形码寡核苷酸将结合至水凝胶以在细胞膜存在的位置形成壳。释放的rna将结合至在细胞膜存在的壳上固定的寡核苷酸，逆转录酶将合成cdna。这就是条码化反应。一旦发生，水凝胶可以被溶解，制备ngs文库的最终步骤就可以批量完成。

15上述工作流程都不需要微流体技术(芯片、油和仪器)，且批量发生。这种形式的一个好处是可支持多步骤反应。例如，如果需要dna基因型信息，流经水凝胶的第一试剂可以是蛋白酶k，例如热敏蛋白酶k。其将消化核小体和染色质辅助蛋白，使dna可及于进一步的分子生物学。通过对细胞膜的破坏，细胞条形码寡核苷酸可以在细胞膜存在的地方结合形

成壳。蛋白酶k可以失活，dna聚合酶与试剂一起流入水凝胶中，例如，可以发生通过模板导向-dna合成条码化。一旦条码化，文库制备的最后步骤可以在水凝胶内部或外部进行。

16细胞可以在其原始培养基中与水凝胶材料混合。一旦固化，可以洗涤水凝胶以去除培养基。此外，由于每个细胞都会有一组细胞条形码克隆的寡核苷酸，所以水凝胶基质中捕捉的每个细胞会被条码化。这两个因素将细胞利用率从起始材料增加到接近100％。

17在一些方面，提供个体细胞或个体细胞核和交联水凝胶的混合物。在一些实施方式中，个体细胞包含附接至个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。

18在一些实施方式中，个体细胞包含锚定于个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含锚定于个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含脂质部分，其中脂质部分将异源条码化寡核苷酸锚定在细胞膜中。

19在一些实施方式中，水凝胶被共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，水凝胶被非共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，该分子选自下组：生物素、链霉亲和素、抗体、适配体、镍(ni)、铕(eu)或包含至少6个连续核苷酸的序列的多核苷酸，其与异源条码化寡核苷酸中的序列完全互补。

20在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，核或细胞包括片段化的核dna，其中片段化的dna在片段末端包含共有衔接子序列。

21在一些实施方式中，水凝胶包括藻酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖、胶原、纤维蛋白(fibrin)、聚乙二醇(peg)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(聚hema)、聚乙烯醇(pva)或聚己内酯(pcl)。

22在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含细胞特异性条形码序列和3’序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续的胸腺嘧啶的多聚t序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如至少8个、至少10个、至少12个，例如6-30个)连续核苷酸的随机序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续核苷酸的目标基因特异性序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如，5-100个，5-25个)连续核苷酸的衔接子。在一些实施方式中，衔接子可以在例如来自细胞或核的片段化dna的末端于共有衔接子序列互补。

23在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸还包含5’pcr柄(handle)序列。

24在一些方面，提供了将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸的方法。一些实施方式中，所述方法包括：提供(i)具有附接至细胞的细胞膜的异源条码化寡核苷酸的细胞或分离的细胞核或(ii)包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸的细胞核；混合该细胞或核与液态水凝胶；在该细胞或核周围交联水凝胶，其中水凝胶形成固体凝胶；从细胞膜或核膜释放异源条码化寡核苷酸以产生释放的异源条码化寡核苷酸；允许该异源条码化寡核苷酸从细胞膜或核膜释放以定位在细胞或核周围的固化的水凝胶上；将异源条码化寡核苷酸附接至细胞多核苷酸或其拷贝或其cdna上，以形成条码化细胞多核苷酸；并溶解固化水凝胶或从固化水凝胶中提取条码化细胞多核苷酸，从而从水凝胶中释放条码化细胞多核苷酸，从而将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸上。

25在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸结合至细胞或核周围的固化的水凝胶。在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸扩散至细胞或核周围的固化的水凝胶，使得异源条码化寡核苷酸定位

蛇形流道用途很多。

1、在微反应芯片中，蛇形流道可以增加反应时间，让反应得以充分的进行。

2、在液滴芯片中，也会在分散相和连续相的进口加上蛇形通道，这个主要是用来缓冲的，当外部条件突然变化时，可削弱其对内部液体的影响。

综上所述，根据小编10年的微流控从业有限的经验来看，也就是这些作用了，供参考。