1 Western Blot原理 Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用 下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。
Westernblot显色的方法主要有以下几种：（1）放射自显影（2）底物化学发光ECL（3）底物荧光ECF（4）底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Westernblot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL 。
2 目的蛋白信号弱或无
在
Westernblot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。凝胶太厚，曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长转膜时间和胶片的曝光时间。
3 非特异性条带 非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。
4 显影后膜上条带处变为**或白色可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。 5 条带内无显影的白点
一般是与转膜和显影的操作有关 ，转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。
6存在散在小圆斑
牛奶封闭液中的杂质颗粒导致，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。
7 Western Blot化学发光(ECL)淬灭的原因？
Western Blot“淬灭”的原因主要在两方面：含HRP的抗体和发光试剂。由于长期应用某种发光试剂，人们多注意了抗体，不知道发光试剂其实也会对实验结果造成重大影响。对抗体方面来说，可以采用适当降低抗体的浓度，发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题；对发光试剂来说，可以选用发光稳定的发光试剂来解决“淬灭”的问题。
8 Western Blot背景太高
背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色，有时候膜没有完全均匀的浸润也是原因之一。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。第四，抗体浓度太高也会导致背景高，建议实验前进行检测。
9 Western Blot中Tween-20的作用是什么？应该怎么用？
Tween-20是一种非离子型表面活性剂。用途为水包油乳化剂、可用作溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂等。气相色谱固定液(最高使用温度120℃)分离分析挥发油、脂肪酸酯、醇、酮和卤化物。
Westernblot的操作流程中大部分都用到TBST洗液，而且还是封闭，一抗二抗孵育这种比较关键的步骤。通常Tween-20作为一种非离子型表面活性剂，效果和SDS、BSA作用差不多。由于膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时可使用Tween20清除去污剂，而且浓度不要超过03%（005%效果最好），如果牛奶封闭效果不好可以提高吐温浓度。
在WB洗液里的吐温是和BSA一样，对抗原抗体蛋白提供保护作用，同时因为是表面活性剂（司盘加成亲水的环氧乙烷基团后的化合物），可以减少抗体对抗原的非特异性作用，用于洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。Tween-20是我们用TBST的时候Tween-20得用量是05ml/L，不加SDS。
10 出现变形条带
凝胶存在气泡或是杂质、电流不稳定、凝胶冷切不均匀。制胶器具和电泳槽保持干净，换新的电解液，保证材料无污染，制胶过程中清除气泡。如电泳槽老化建议换新。尽量选择中间孔加入样品，避免两端上样。
1． 酸性磷酸酶（ Acid phosphatase）Gomori 氏显示法，其孵育液成分有（1）005M醋酸缓冲液PH5,(2)β-甘油磷酸钠,(3)醋酸铅,(4)5%氯化镁试述该孵育液各成分的作用如何
调节 ph
底物
捕捉剂
激活剂
2酶组化对照实验的方法有几种
显示酶的细胞化学染色法都需用酶的抑制剂处理作为对照实验。
特异性抑制剂：如四异丙基焦磷酰胺对ChE
非特异性抑制剂：热
竞争性抑制剂：如丙二酸钠对SDH
假阳性结果可用下列对照排除非酶反应的干扰
1切片在保温前用沸水、强酸、氧化剂和重金属等处理使酶破坏。
2用特异性抑制剂
3免去底物。
3凝集素-ABC法能特异的显示组织标本中什么成分试简述其原理
亲和素（Avidin）可与生物素或荧光素、酶等偶联
生物素（Biotin）可与抗体交联，也可与酶标记物结合。
凝集素它一方面能与细胞膜的游离面和胞内膜囊内表面上的特定糖链结合，另一方面又可以和荧光素、HRP、铁蛋白、胶体金、生物素等结合，使胞膜上的单糖可视化
亲和物质之间有高度亲合力，而且可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白等相结合。
凝集素是一种无免疫源性糖蛋白或结合糖的蛋白质，它一方面能与细胞膜的游离面和胞内膜囊内表面上的特定糖链结合，最大特点是结合的专一性，每一种凝集素只对某一种特殊的碳水化合物有特异亲和力，其结合能力还因受体（糖链）的空间结构、结合位点而异。另一方面又可以和荧光素、HRP、铁蛋白、胶体金、生物素等结合，使胞膜上的单糖可视化，用于亲和组化或亲和免疫组化。人们可利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征。
4试述显示琥珀酸脱氢酶(硝基蓝四唑盐法)需注意之要点
1。对标本的处理和制片不能影响酶的活性及分布
2。 所选择的底物及辅助物必须能迅速和同步地渗透到组织和细胞中去。
3。所选择的底物最好只能被一种酶催化分解。
4。所选择的辅助物不影响酶活性和其他反应剂穿透进入细胞。
5。PRP 必须能迅速与辅助物进行反应，且FRP是水不溶性的有色而稳定的物质。
6。所有参加反应的试剂都不能与组织细胞内除了所检测的酶以外的任何成分自行吸附或结合。
5免疫组化实验应注意哪些事项
组化技术要求：
1保存生活形态结构：选择固定方法及种类
2保存化学成分：了解被检测物特性。
3保存定位：使反应产物在原位沉淀、色深、不溶，调整反应条件。
3有高度特异性：需对照实验，识别假阳性。
二、 填空
1．显示脂类的最好固定剂为（甲醛 ），制片方法为（ 冰冻切片或明胶切片
），封固剂为（ 甘油明胶 ）。
2．荧光染色中激发滤片的选择是根据荧光染料的最大（ 吸收 ）波长，阻断滤片的选择是根据其最大荧光（ 反射 ）波长。
3．甲绿在配制时，应用氯仿去除其中的（甲基紫 ）
4．可对单个细胞逐个进行高速准确的定量分析和分类的新技术是（ 流式细胞仪 ）。在单个细胞中，可同时测得DNA,RNA及细胞体积3个参数，也可测核与细胞的比例，蛋白质和免疫标志的其它参量。
5．以物质分子对光波的选择性吸收为基础，在显微镜下对生物样品微细结构中的化学物质进行定量测定的方法是（ 显微分光光度计 ）
HRP是辣根过氧化酶
蛋白保护剂包括：BSA等标准蛋白，增加蛋白总浓度，防止降解。防腐剂如叠氮钠，防止蛋白溶液长细菌等。至于蛋白酶抑制剂只用于细胞或组织裂解液，一般纯化的蛋白无需添加。所以楼主说的保护剂应该就是BSA和防腐剂。
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。
与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
蛋白质样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1培养细胞或药物处理。
2弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3加入1X SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。
4超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5煮沸样品5min。
6离心12000g，5min，取上清。
SDS-PAGE电泳
一、清洗玻璃板
二、灌胶与上样
1 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2 配 10％ 分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
3 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4 配 4％ 的浓缩胶, 加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6 在电泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。
7 连接电泳槽到电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压70～ 80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。
转膜
1 将胶浸于转移缓冲液中平衡 10min。注意：若检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2 依据胶的大小剪取膜和滤纸6 片， 放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5 秒钟。
3 装配转移三明治:海绵3层滤纸胶膜，3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面(黑色面)。
4 将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液， 插上电极，100V，1h(电流约为 03A)。
5 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。
封闭与杂交
1用25ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。
2置膜于25ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。
315mlTBS/T洗3次(5min/T)。
4加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
515ml TBS/T洗3次(5min/T)。
6加入合适稀释度的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
715ml TBS/T洗3次(5min/T)。
815ml TBS洗1次。5
显色
将 A、B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B 混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min 左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
WB 中常见的问题以及处理办法。
一、信号强度低
信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：
① 样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；
② 蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF 的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；
③ 蛋白的转膜。运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间。
④ 抗体的运用。抗体的反响种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；
⑤ 蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl 浓度等；
⑥ 抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间；
⑦ 甲醇浓渡过高。会招致蛋白质与 SDS 别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。
二、非特异性条带或条带位置不对
WB 结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。普通来说惹起这类问题的主要要素有：
① 抗体的非特异性分离。通常以为，多抗的特异性不如单抗，更容易产生非特异性条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异性分离的可能，倡议设二抗阴性对照；
② 样品蛋白量过高。恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与封锁时间可防止蛋白量过高对实验结果的不良影响；
③ 蛋白质降解。会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品；
④ 细胞传代次数过多。会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株；
⑤ 蛋白存在复合物。有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物；
⑥ 蛋白存在剪接体或多种修饰方式。局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活性，在 WB 中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot 来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。
三、背景过高
在局部 WB 结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观，难以用于文章发表。这种问题的可能缘由有以下几点：
① 封锁不充沛。背景过高的主要缘由之一是封锁有问题，倡议运用适宜的封锁剂（脱脂奶粉、BSA 等），优化反响浓度与封锁时间，同时留意防止呈现抗体与封锁剂的穿插反响，以及封锁剂与含有目的抗原，内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题；
② 洗膜不充沛。恰当增加洗膜次数弛缓冲液体积，进步吐温20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的问题；
③ 抗体的运用。一抗浓渡过高是高背景的缘由之一，且二抗也存在与封锁剂非特异性分离的可能，因而倡议恰当优化一抗浓度，并设二抗阴性对照；
④ 曝光时间长。倡议在实验中采用适宜的曝光时间。
四、条带弥散或外形怪异
有时 WB 结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下：
① 电泳时电压、电流过高。会招致条带迁移速率过快以及 SDS-PAGE 温度升高，并可能使得条带弥散、外形变形。倡议运用适宜的电泳条件并坚持低温；
② 电极不均衡。会招致条带偏斜，上样时在无样品的胶孔中参加等量样品缓冲液可防止这种状况；
③ 上样量过高，样品中盐离子浓度较大。上样量过高可能会招致条带弥散，样品中的盐离子浓度不分歧则会招致条带不齐等问题。因而在上样时需保证样品量分歧且恰当，并坚持相同的、较低的盐离子浓度。
④ 制胶问题。在配胶时一定要保证充沛混匀，平均凝胶，上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡。
⑤ 电泳缓冲液寄存过久。电泳实验中的缓冲液假如放置过久也会对结果有不良影响，因而倡议及时改换新的缓冲液。
五、膜上分布不平均的污点
有时在 WB 做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点：
① 试剂、仪器等污染。倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂；
② 转膜时有气泡。确保在转膜过程中将气泡扫除洁净；
③ 抗体孵育时与膜接触不充沛。确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；
④ 曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；
⑤ 膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。
问题一：铁皮石斛如何吃可以降低血糖？ 现在的人吃得好了就难免血糖高，患上糖尿病的人也就多。中国古代把糖尿病称为“消渴症”，病因有多方面，和人的饮食生活习惯有很大关系，也有是因为胰腺分泌不足引起的。糖尿病可怕之处在于非常顽固，一旦患上了难以治好，而且会有很多其它并发症，服药降血糖或是注射胰岛素都会有副作用，难以长期坚持。 有医学研究对铁皮石斛降血糖的作用及其机理进行了分析，从人的血糖值、血清胰岛素和胰岛血糖素水平等各方面，采用放射免疫分析和免疫组化HRP-SPA染色体等方法，结合胰岛α细胞和β细胞的形态方面，发现铁皮石斛确有明显的降血糖作用。专家发现铁皮石斛能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰岛a细胞分泌胰高血糖素，还能促进肝糖原合成，这项研究成果为铁皮石斛用于糖尿病提供了依据。 人患糖尿病的基本病因就是阴虚燥热、脏腑受损，而铁皮石斛正是通过滋养五脏六腑来抑制糖尿病的，还可以预防并发症。中医认为铁皮石斛的最佳食用方法就是新鲜地吃，中医在使用铁皮石斛时，常会选用新鲜铁皮石斛。精选的优质新鲜铁皮石斛最大程度上保持了铁皮石斛的营养及成分，因为未经加工，铁皮石斛所含有效成分也更易于被人吸收利用。 在新鲜铁皮石斛的吃法上，一般要先将它洗干净。可以直接食用，也可以拍烂或切碎和其它的降血糖食物一起食用。
问题二：铁皮石斛可以降血糖吗 你好，铁皮石斛是可以降血糖的。它是属于补益药中的补阴药：益胃生津，滋阴清热。
除了降血糖，还可以增强机体免疫力,铁皮石斛石斛具有生津作用，主要表现为促进腺体分泌和脏器运动。
降血糖的话，也可试试绞股蓝这种中草药。主要有效成份是绞股蓝皂甙、黄酮类、多种维生素、微量元素、矿物质等。
问题三：石斛可以降血糖吗 石斛可以降血糖，但是要选对石斛，铁皮石斛属于保健，含糖量高，
所以降血糖建议选择药用石斛金钗石斛，金钗味道苦，对降血糖比较有功效
问题四：石斛配什么降血糖 石斛可以降血糖，但是要选对石斛，铁皮石斛属于保健，含糖量高， 所以降血糖建议选择药用石斛金钗石斛，金钗味道苦，对降血糖比较有功效
问题五：铁皮枫斗，能降血糖吗？ ，我爷爷就在用，最近我爷爷血压确实低了很多，这个铁皮枫斗胶囊可以降血糖、血脂，护肝利胆、促进消化、滋阴名目、能提高人体免疫能力;增强记忆力;补五脏虚劳;抗衰老;抑制肿瘤;改善糖尿病症状;抗缺氧;对放化疗以及夜生活、烟酒过度者有显著效果
问题六：石斛泡水喝能降血糖吗 石斛主要调理肠胃增强自身免疫功能的对降血糖应该有一定的辅助效应的。
问题七：怎么吃石斛才能有很好的降血糖作用 干银耳冲洗后用水泡发，枸杞洗净用少许水浸泡一会。
将新鲜铁皮石斛的叶子揪掉，茎洗净后，切成小段。
泡好的银耳用流动水冲洗干净，撕成小朵。
砂锅中倒入水，把铁皮石斛段和银耳放入，大火煮开后，转小火
30分钟时将枸杞和冰糖倒入，继续炖至银耳软糯即可。
问题八：石斛会降血糖吗？ 我们家是种植铁皮石斛的，对这个有所了解。
铁皮石斛古代被中医用来治疗消渴症，实际上以前的消渴症就是我们现在类似的糖尿病，但铁皮石斛没有治愈糖尿病的作用，有缓解维稳糖尿病的作用。
希望我的建议对你有所帮助，望采纳，谢谢～～
问题九：昌弘铁皮石斛能降血糖吗？ 以前听人说起来我还是不太确定，然后特意去了解了一下，答案是可以的。
问题十：糖尿病人可以吃石斛吗 糖尿病人可以服用石斛，医书记载：石斛性平、味甘、无毒，功能：养胃生津，滋阴除热，消渴。消渴是指消谷善饥，口渴多饮，并因多饮而多尿，由消耗而致消瘦之证。它是一个独立的证候，《内经》中称本病为消瘅、&q工ot;鬲消、肺消、消中，提示本病与多脏器有关系。主要涉及西医学之糖尿病。石斛滋阴生津的功效对糖尿病是疗效的，现代医学也有很多关于石斛对症糖尿病的研究和病例。
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