如何选择合适的蛋白含量测定方法

选择一种蛋白测定方法时，需要考虑两个重要因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。基于dford方法的Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白测定灵敏度高，可以兼容糖、巯基乙醇、DTT等。而对于去污剂和NaOH这两种干扰Bradford测定的物质，DC蛋白测定却可以兼容。

如果蛋白是在loading buffer中，准备跑1D或2D电泳，或者刚从细胞裂解液中抽提出来，需要定量，那么RC DC蛋白测定更合适。

扩展资料：

常见测试方法：

Quick Start Bradford 蛋白测定是一种简单、精确的蛋白浓度定量方法。现成的1倍浓度染料和7 个预稀释浓度(0125、025、05、 075、10、15、20 mg/ml)的蛋白标准品，让你拥有现成的检测工具。无需稀释标准品和染料，一步完成蛋白浓度定量。

Bio–Rad 蛋白测定 也是一种简单的蛋白浓度测定方法。该方法适应标准浓度测定、低浓度微量测定，或96孔微孔板的快速测定。它的基本原理和流程和上面的Quick Start Bradford都是一样的，不过要麻烦一点点。因为除了要稀释蛋白标准品，配成几个不同浓度之外，还要稀释染料，再过滤除去不溶颗粒。

Quick Start Bradford 和Bio–Rad 蛋白测定方法的起源都是Bradford染料结合方法 (Bradford 1976)，该方法检测考马斯亮蓝G–250染料与蛋白结合时(主要结合碱性或芳香族氨基酸残基)的颜色变化。这种测定方法能定量多数蛋白或多肽(分子 量> 3,000–5,000 Da)，操作简单、速度快，灵敏度高，与一些还原剂(如DTT、巯基乙醇)兼容。

DC (Detergent Compatible) 蛋白测定 是一种适用于含有去垢剂的蛋白样品比色测定方法。该方法类似于常规的Lowry 测定方法 (Lowry et al1951)，但经过改良，节省了操作时间。DC 蛋白测定只需要15分钟的温育过程，而且吸光值读数能保持2小时的稳定。

RC DC (Reducing agent Compatible & Detergent Compatible) 蛋白测 定是一种适用于含还原剂和去垢剂的蛋白样品比色测定方法。

以 Lowry 方法(Lowry et al1951)为基础的 RC DC 蛋白测定，具有原来DC蛋白测定的特点，并能与更多的试剂兼容，简化了复杂蛋白样品溶液的定量测定。吸光值至少稳定1小时。

除了与DC 蛋白测定兼容的试剂外，RC DC 蛋白测定还与以下试剂和缓冲液兼容：2% CHAPS、350 mM DTT、01M EDTA 、Laemmli 缓冲液、10% beta-巯基乙醇、ReadyPrep 抽提试剂等。

--BCA蛋白浓度检测

实验一 生物组织中脂肪,蛋白质的鉴定

一,实验原理

(1)鉴定实验设计的理念:

某些化学试剂 + 生物组织中有关有机化合物 产生特定的颜色反应

(2)具体原理:

1、脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘**小颗粒

2、蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应

二,目标要求

初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法

三,重点,难点

1重点

①初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法

②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力,掌握探索实验设计技巧,从而培养创新思维能力

2难点

根据此实验方法,原理,设计实验来鉴定常见食物的成分

四,实验材料

1脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h)

2蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白)

五,仪器,试剂

1仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜

2试剂：1苏丹Ⅲ染液;2双缩脲试剂;3 体积分数为50%的酒精溶液;4蒸馏水

六,方法步骤

（1）脂肪的鉴定

脂肪的鉴定步骤:

取材:花生种子(浸泡3-4h),将子叶削成薄实验一 生物组织中脂肪,蛋白质的鉴定

一,实验原理

(1)鉴定实验设计的理念:

某些化学试剂 + 生物组织中有关有机化合物 产生特定的颜色反应

(2)具体原理:

1、脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘**小颗粒

2、蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应

二,目标要求

初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法

三,重点,难点

1重点

①初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法

②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力,掌握探索实验设计技巧,从而培养创新思维能力

2难点

根据此实验方法,原理,设计实验来鉴定常见食物的成分

四,实验材料

1脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h)

2蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白)

五,仪器,试剂

1仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜

2试剂：1苏丹Ⅲ染液;2双缩脲试剂;3 体积分数为50%的酒精溶液;4蒸馏水

六,方法步骤

（1）脂肪的鉴定

脂肪的鉴定步骤:

取材:花生种子(浸泡3-4h),将子叶削成薄片

取理想薄片

在薄片上滴2-3滴苏丹Ⅲ染液

去浮色

制成临时装片

观察:先在低倍镜下,找到材料的脂肪滴,然后,转为高倍镜观察

结论:细胞中的圆形脂肪小颗粒已经被染成橘**

实验成功的要点:

①脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h)

②该试验成功的关键是获得只含有单层细胞理想薄片

③滴苏丹Ⅲ染液染液染色2-3min,时间不宜过长,以防细胞的其他部分被染色

（2）蛋白质的鉴定

蛋白质的鉴定步骤:

选材:卵清稀释液或黄豆(浸泡1-2d) 豆浆 滤液

结论:蛋白质与双缩脲试剂发生紫色反应

2,实验成功的要点:

①蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白稀释液)

②双缩脲试剂的使用,一定要先加入A液(即01 g/ml的 NaOH 溶液),再加入双缩脲试剂B液(即001 g/ml的 CuSO4 溶液)

③还可设计一只加底物的试管,不加双缩脲试剂,进行空白对照,说明颜色反应的引起是蛋白质的存在与双缩脲试剂发生反应,而不是空气的氧化引起

关于几种坊间流传的 蛋白粉检测法写在文章前，文章乃原创，您要是转帖，受累注明下出处，我没说我写的多少，但是多少尊重下别人的劳动成果，您受累，本帖精华取自剑眉同学和老岳同学共炮制。均不靠谱，所以你要是想知道这些方法有没有检测蛋白质真伪的可能性，我只能告诉你，没可能，本文的中心思想也在于此，所以您要是不想看看究竟为哪般，可以继续看下去，而检测所谓的蛋白质真伪，也没有任何民间法子，起码目前没有靠谱的。先说“火烧法”我曾几何时也认为这个法子有可信度具体实践方式为，那一小撮蛋白粉，然后点燃了，这时候会发出一股子味道，类似烧羊毛、烧头发一类的味道，原理是因为，毛发的主要构成物也是蛋白质，所以会出来一个味道。这个方法看似合理，但是缺有很大的漏洞。比如，咱们喝的蛋白粉是有配方的，你点燃以后，里面的人工合成味道剂也会一起点燃，所以味道闻起来肯定有所差别。而且嗅觉判断本身就有一定的主观色彩，这就好比有人不喜欢油漆味，有人偏喜欢油漆味，所以这个方法很不可靠。再说“开水烫法”咱们现在喝的蛋白粉，大部分是通过低温水解一类的技术萃取的，然后再经过人体的氨基酸吸收、膳食比例一类的搭配成各种配方，所以这类的蛋白质分子在高温下会结晶，当然，这个结晶绝非肉眼可以直接观察到的，一般在往上看比较普遍的说法就是蛋白粉会抱团，所以这个方法一直被大伙所接受。但是这个方法实际上不靠谱，因为蛋白质遇热结晶不代表蛋白粉就直接抱团，更不是说你能用肉眼看见蛋白粉变成一个大面疙瘩了，实际上你要是有心的话，在他抱团后，搅拌搅拌还是可以给搅和开的，要是用摇杯更是可以叫他貌似溶解了，但是这个时候实际上蛋白质已经“变态”了。而且，缓释类的蛋白粉，一般蛋白质含量是50%，比如BSN的一勺44克，只有22克是蛋白质成分，所以这种冲开水法对其没啥效果，从另一个角度看，这个方法也是在暴敛天物。再说比较风靡的“隔夜臭法”首先从技术层面来说，蛋白粉隔夜臭说明蛋白质变质而已，蛋白质变质不能作为评判蛋白粉真伪的标准，第二天臭了，只是因为蛋白质变质发霉了。而且比如乳清蛋白可能会容易臭一些，但是缓释蛋白可能不那么容易臭，因为由于配方等原因，他本身蛋白质含量也不能和乳清一样。的国标，要是想检测，直接去当地质监局，就算当地技术条件有限，起码他的营养成分不会和营养成分表上有太大的出入，某些基础的检测，要是学过化学的，基本上自己就可以做了。顺便说一下，因为有人质疑，我再补充几点而且你说的Lowry法测定本身就复杂，也许对你天资聪明的你来说很简单，而且千万别把这个推到高中化学的水平。3：Lowry法在对不同生物产品，蛋白质半成品的时候很多结果定氮法都有出入，结果相差很多

1：用双缩脲试剂检测,呈现紫色就有蛋白质:

2：双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成

3：双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为01 g/mL的水溶液；

4：双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为001 g/mL的水溶液:

5：双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在

具体方法是：

1：先将双缩脲试剂A加入组织样液,摇荡均匀（必须营造碱性环境）,在加入双缩脲试剂B,摇荡均匀:

2：如果组织里含有蛋白质,那么会看到溶液变成紫色具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应

3：蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比:

4：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物:

5：双缩脲试剂本是用来检测双缩脲,因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验蛋白质,与蛋白质接触后的颜色呈紫色

希望我的回答对你有帮助！

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。

与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

蛋白质样品制备

原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

1培养细胞或药物处理。

2弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。

3加入1X SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。

4超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。

5煮沸样品5min。

6离心12000g，5min，取上清。

SDS-PAGE电泳

一、清洗玻璃板

二、灌胶与上样

1 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

2 配 10％ 分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

3 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4 配 4％ 的浓缩胶, 加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

6 在电泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。

7 连接电泳槽到电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压70～ 80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。

转膜

1 将胶浸于转移缓冲液中平衡 10min。注意：若检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。

2 依据胶的大小剪取膜和滤纸6 片， 放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5 秒钟。

3 装配转移三明治:海绵3层滤纸胶膜，3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面(黑色面)。

4 将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液， 插上电极，100V，1h(电流约为 03A)。

5 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

封闭与杂交

1用25ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。

2置膜于25ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。

315mlTBS/T洗3次(5min/T)。

4加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。

515ml TBS/T洗3次(5min/T)。

6加入合适稀释度的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。

715ml TBS/T洗3次(5min/T)。

815ml TBS洗1次。5

显色

将 A、B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B 混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min 左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。

取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

WB 中常见的问题以及处理办法。

一、信号强度低

信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：

① 样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；

② 蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF 的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；

③ 蛋白的转膜。运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间。

④ 抗体的运用。抗体的反响种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；

⑤ 蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl 浓度等；

⑥ 抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间；

⑦ 甲醇浓渡过高。会招致蛋白质与 SDS 别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。

二、非特异性条带或条带位置不对

WB 结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。普通来说惹起这类问题的主要要素有：

① 抗体的非特异性分离。通常以为，多抗的特异性不如单抗，更容易产生非特异性条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异性分离的可能，倡议设二抗阴性对照；

② 样品蛋白量过高。恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与封锁时间可防止蛋白量过高对实验结果的不良影响；

③ 蛋白质降解。会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品；

④ 细胞传代次数过多。会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株；

⑤ 蛋白存在复合物。有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物；

⑥ 蛋白存在剪接体或多种修饰方式。局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活性，在 WB 中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot 来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。

三、背景过高

在局部 WB 结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观，难以用于文章发表。这种问题的可能缘由有以下几点：

① 封锁不充沛。背景过高的主要缘由之一是封锁有问题，倡议运用适宜的封锁剂（脱脂奶粉、BSA 等），优化反响浓度与封锁时间，同时留意防止呈现抗体与封锁剂的穿插反响，以及封锁剂与含有目的抗原，内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题；

② 洗膜不充沛。恰当增加洗膜次数弛缓冲液体积，进步吐温20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的问题；

③ 抗体的运用。一抗浓渡过高是高背景的缘由之一，且二抗也存在与封锁剂非特异性分离的可能，因而倡议恰当优化一抗浓度，并设二抗阴性对照；

④ 曝光时间长。倡议在实验中采用适宜的曝光时间。

四、条带弥散或外形怪异

有时 WB 结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下：

① 电泳时电压、电流过高。会招致条带迁移速率过快以及 SDS-PAGE 温度升高，并可能使得条带弥散、外形变形。倡议运用适宜的电泳条件并坚持低温；

② 电极不均衡。会招致条带偏斜，上样时在无样品的胶孔中参加等量样品缓冲液可防止这种状况；

③ 上样量过高，样品中盐离子浓度较大。上样量过高可能会招致条带弥散，样品中的盐离子浓度不分歧则会招致条带不齐等问题。因而在上样时需保证样品量分歧且恰当，并坚持相同的、较低的盐离子浓度。

④ 制胶问题。在配胶时一定要保证充沛混匀，平均凝胶，上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡。

⑤ 电泳缓冲液寄存过久。电泳实验中的缓冲液假如放置过久也会对结果有不良影响，因而倡议及时改换新的缓冲液。

五、膜上分布不平均的污点

有时在 WB 做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点：

① 试剂、仪器等污染。倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂；

② 转膜时有气泡。确保在转膜过程中将气泡扫除洁净；

③ 抗体孵育时与膜接触不充沛。确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；

④ 曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；

⑤ 膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。