培养基的灭菌流程

原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等另外,培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质,是应用最广的凝固剂加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化,于45℃以下凝固但多次反复融化,其凝固性降低

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌,以备纯培养用一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌

3材料

31器皿及材料

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱

32药品试剂

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液

4流程

称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板

5步骤

51培养基的制备

511称量药品

根据培养基配方依次准确称取各种药品,放入适当大小的烧杯中,琼脂不要加入蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速

512溶解

用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中,在放有石棉网的电炉上小火加热,并用玻棒搅拌,以防液体溢出待各种药品完全溶解后,停止加热,补足水分如果配方中有淀粉,则先将淀粉用少量冷水调成糊状,并在火上加热搅拌,然后加足水分及其它原料,待完全溶化后,补足水分

513调节pH

根据培养基对pH的要求,用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH测定pH可用pH试纸或酸度计等

514溶化琼脂

固体或半固体培养基须加入一定量琼脂琼脂加入后,置电炉上一面搅拌一面加热,直至琼脂完全融化后才能停止搅拌,并补足水分(水需预热)注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦

515过滤分装

先将过滤装置安装好（图3-1）如果是液体培养基,玻璃漏斗中放一层滤纸,如果是固体或半固体培养基,则需在漏斗中放多层纱布,或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤过滤后立即进行分装分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口,以免浸湿棉塞, 引起污染液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜固体分装装量为管高的1/5,半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶,其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜

516包扎标记

培养基分装后加好棉塞或试管帽,再包上一层防潮纸,用棉绳系好在包装纸上标明培养基名称,制备组别和姓名、日期等

517灭菌

上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌普通培养基为121℃20min,以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份培养基经灭菌后,如需要作斜面固体培养基,则灭菌后立即摆放成斜面(图3-2),斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后,垂直冷凝成半固体深层琼脂

518倒平板

将需倒平板的培养基,于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板

52灭菌方法

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力

521高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的当蒸汽压力达到105kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15～30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）

5211操作方法和注意事项如下

加水

打开灭菌锅盖,向锅内加水到水位线立式消毒锅最好用已煮开过的水,以便减少水垢在锅内的积存注意水要加够,防止灭菌过程中干锅

装料、加盖

灭菌材料放好后,关闭灭菌器盖,采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋,使蒸汽锅密闭,勿使漏气

排气

打开排气口(也叫放气阀)用电炉加热,待水煮沸后,水蒸气和空气一起从排气孔排出,当有大量蒸汽排出时,维持5min,使锅内冷空气完全排净

升压、保压和降压

当锅内冷空气排净时,即可关闭排气阀,压力开始上升当压力上升至所需压力时,控制电压以维持恒温,并开始计算灭菌时间,待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃,20min）后,停止加热,待压力降至接近“0”时,打开放气阀注意不能过早过急地排气,否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外

灭菌后的培养基空白培养

灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养,经24h培养无菌生长,可保存备用；斜面培养基取出后,立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后,空白培养

522干热灭菌法

通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌一般是把待灭菌的物品包装就绪后,放入电烘箱中烘烤,即加热至160～170℃维持1～2h

干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌凡带有胶皮的物品,液体及固体培养基等都不能用此法灭菌

5221灭菌前的准备

玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌

5222干燥箱灭菌

将包扎好的物品放入干燥烘箱内,注意不要摆放太密,以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h,注意勿使温度过高,超过170℃,器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧如果是为了烤干玻璃器皿,温度为120℃持续30分钟即可温度降至60～70℃时方可打开箱门,取出物品,否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂

用此法灭菌时,绝不能用油、蜡纸包扎物品

5223火焰灭菌

直接用火焰灼烧灭菌,迅速彻底对于接种环,接种针或其它金属用具,可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌此外,在接种过程中,试管或三角瓶口,也采用通过火焰而达到灭菌的目的

一湿热灭菌的原理与要求二湿热灭菌设备 (一)高压蒸汽灭菌器 (二)快速冷却灭菌器 (三)水浴式灭菌器 (四)回转式水浴灭菌器 湿热灭菌是指物质在灭菌器内利用高温高压的水蒸气或其他热力学灭菌手段杀灭细菌的方法。 特点:比热容大，穿透力强，容易使蛋白质变性或 凝固，故其灭菌可靠、操作简便、易于控制、具有 效率高，经济实用等特点。但不适用于对湿热敏感 的药物。 1原理：蒸汽释放潜热，使细菌蛋白质、核酸、酶变性，最后导致细菌死亡。 二湿热灭菌设备(一)高压蒸汽灭菌器：有手提式、卧式、立式movie 1基本原理:以蒸汽为灭菌介质，用一定压力得饱和 蒸汽，直接通入灭菌柜内，对待灭菌品进行加热, 冷凝后的饱和水及过剩的蒸汽由柜体底部排出。 2系统介绍:合金制成、夹套、格车(网格架)压力表两只、温度计一只,安全阀、里柜放气阀、 总来气阀(侧面)、里柜进气阀、外柜排气阀以 及外柜放水阀。 3主要特点:(1)广泛使用于输液瓶、口服液的灭菌、操作简单、方 (2)升温、保温和降温靠阀门控制。(3)柜内空气要排净,否则灭菌不完全。 (4)自然降温,时间长,药液容易变黄。 (5)开门时,温差大,易引起爆炸。 4工作过程:(1)打开夹套，加热10min，至升至所需压力 (2)物品入柜 (3)夹套加热完成后，在通入柜内 (4)T=1155；P=70KPa 记时 (5)完成关闭气阀，逐渐打开排气阀，P=0 (6)取物品 5动力参数 T=1155；P=70KPa 6设备操作: 注意事项:(1)先进行灭菌条件的试验，确保灭菌效果 (2)必须把冷空气全部排出 (3)灭菌时间的计算 (4)灭菌结束的操作 7维护保养 (1)必须按压力容器规范进行维护保养 (2)定期校对压力表、安全阀、温度计 (3)保持箱内清洁，定期消毒 (4)清洗干净将门关闭，但不要紧锁 10 (二)快速冷却灭菌器 适用于瓶装液体及软包装 图示: 缺点:柜内温度不均匀，快速冷却容易引起爆炸 蒸汽 冷却 冷却 11(三)水浴式灭菌器: 安瓿瓶、输液瓶、口服液等制剂、塑料瓶(袋)、 食品行业的灭菌。计算机控制，高温水直接喷淋灭菌， 冷却水间接冷凝。 1基本原理：以去离子水为载热介质对输液进行加 热、升温、保温(灭菌) 、冷却。加热 和冷却都是在柜外的板式热交换器Flash中 进行的。 12 密封门3系统介绍 管路系统 控制执行系统 13 4主要特点 安全可靠5工作过程: 装料、注水、升温、灭菌、冷却、排去离 6动力参数7设备操作 8维护保养 14 Flash 15 Flash16 6测量F值的功能17 Flash 18 Flash 19 Flash 设备特点本设备具备双层水浴式杀菌锅的特点，而且比双层杀菌锅提高1倍的产量，节约能源和 时间 自动切换锅内水流方向，温度均匀无死角。高温短时间双锅交叉灭菌，节约时间、节约能 源、省人工。 全程电脑自动化控制，无需人工操作。 采用温度薄膜调节阀自动调节锅内温度，杀菌 精确度高。 测量F值功能。 根据不同产品设定多种专职灭菌公式。

首先它是压力容器，必须要满足中国压力容器标准，并且它的设计压力和工作压力要符合标准。其次是温度的问题，温度要能够达到灭菌要求，一般是在115或121摄氏度，而且不仅温度要达到，内室的均匀性也必须要保证，整个柜内的温度偏差不能超标。

用灭菌水。有些细胞对氯含量较高的消毒剂会有抵抗性，因此灭菌水的制备使用专门的无菌过滤器过滤去离子水，再经过高压蒸汽灭菌器进行消毒。在使用灭菌水消毒时，还需要注意对环境和个人卫生的管理，如检查操作桌子是否干净，保持洁净的操作区域等。

水浴灭菌柜是一种常用的实验室设备，通常用于对实验器皿、工具等物品进行灭菌处理。水浴灭菌柜出现的异常情况可能会影响灭菌效果和设备使用寿命，主要包括以下几个方面：

温度异常：水浴灭菌柜内部温度过高或过低，可能导致灭菌不彻底或无法达到灭菌要求。

水位异常：水浴灭菌柜内部水位过高或过低，可能导致水浴液的加热或保持温度功能失效。

电力故障：设备供电系统出现故障，如电源插头松动、电源线短路等，可能导致设备无法正常工作。

设备老化：由于长时间使用或不当维护，设备零部件损坏或老化，可能导致设备性能下降、故障频繁出现。

影响水浴灭菌柜的因素包括但不限于以下几个方面:

操作人员技术水平：操作人员的技术水平和经验将直接影响水浴灭菌柜的使用效果。

水浴液的质量：水浴液的成分和质量将影响设备的稳定性和灭菌效果。

设备的维护保养：定期对设备进行检查、保养和维修，可以延长设备使用寿命和确保设备的正常工作状态。

环境因素：仪器放置的环境也会影响仪器的使用寿命。如温度过高、潮湿等因素都会影响设备的性能和寿命。