色谱柱的作用是什么

分离化合物。

色谱柱是一种用于分离化合物的重要工具。它由填充在管子中的吸附剂或分子筛组成，当样品通过这些填料时，化合物会因其在填料中的亲和力不同而按照一定顺序被逐步分离出来。根据不同的原理和填充材料，色谱柱可以分为多种类型，如气相色谱柱、液相色谱柱、离子交换色谱柱等。它们广泛应用于生命科学、药物研发、环境监测等领域中的分析和纯化过程中。

色谱柱的选择应该根据实验需求和目标化合物的性质来确定，包括分子量、极性、酸碱性等因素。此外，在使用色谱柱进行实验时，还需要注意保持柱温、流速等操作参数的稳定，以获得准确可靠的结果。

预柱和保护柱是不一样的。保护柱位置在柱前进样阀后主要是做样是过滤一下样品的污染物。

预柱的位置是在泵后，主要做样是饱和流动相和过滤流动相的做样，现在很少使用预柱。

保护柱的损坏有几个方面一、造成样品峰型变坏，这基本是冲洗不好的。二、造成柱效下降，一般造成下降30%，保护柱就可以报废了。

至于色谱柱的冲洗，根据不同的柱子型号、样品性质等方面去具体的冲洗，情况比较复杂。使用前多看看说明书，可以和色谱柱供应商的技术人员沟通，怎么使用。

冲洗的时候注意是压力，最好是从小流速开始慢慢提升流速到压力许可的范围。冲洗的时间，大家都有个误区就是冲洗时间用分钟或小时计算是不准确，准确的是流量一般色谱柱的冲洗都要达到10-20倍的柱体积。

以上只是大概的过程，具体还有很多的细节，需要一点点的去注意

当液相柱压不稳定时可以进行以下操作：

1、检查是否脱气，压力不稳定很可能是管路中有气泡。

2、更换密封垫，泵密封垫损坏，会把空气带进泵内。

3、打开泵的排气阀，按purge健排气，或者以大流速（2ml/m）排气，流动相真空脱气或者超声脱气。

4、换下双泵,冲洗阀的过滤芯，将流动相混合均匀后,超声20min后,真接单泵分析就可。

5、检查是否是柱子久用引起的柱压不稳，用异丙醇：甲醇＝10:90冲，流速要调低。

在选择色谱柱之前，先多了解自己的样品和杂质，他们的类型结构、极性、酸碱性、分子量大小等等。

1样品是极性的且弱酸性的，就可以选择C18在100%酸性水溶液条件下检测，即要选择承受100%纯水且对极性化合物保留很好的色谱柱。

2 如果样品极性太强，或酸性太强，可以选择CN，NH2，或硅胶柱，HILIC（亲水色谱），也有使用C18+强阴离子对试剂或强阴离子交换色谱柱。

（缺点是离子对试剂平衡时间长，对流动相pH要求比较精密，否则很难重复实验，另外离子对试剂很难洗下来，基本上用了离子对的色谱柱就不能再用于其它实验）。

3 若样品是碱性的，可选择高纯硅胶柱（高纯硅胶缺少金属杂质，且硅胶端基封尾）或一些经过修饰的C18柱（如极性嵌入技术或碱去活技术等）。

他们都会减少碱性化合物的拖尾，一般会选择中性或偏碱的条件下做，因为这样可增加碱性样品的保留。

4如果碱性化合物的极性太强，或碱性太强，可以选择宽pH的C18色谱柱在高pH值检测（优点是方法开发简单，缺点是目前实 现这一技术的色谱柱品牌比较少，价格也高）。

或者选用HILIC色谱柱（硅胶柱在反相条件下使用，这也是很经典的检测碱性样品的方法）选择强离子交换柱也有使用C18+强阴离子对试剂或强阴离子交换色谱柱。

-液相色谱柱

首先建议楼主可以到专业的行业论坛进行提问，因为论坛里常常会遇到和你有过相同遭遇的人，这样解决问题更为准确啊~~我一般常常上仪器信息网论坛（http://wwwinstrumentcomcn/bbs/）主要是这个坛子专业性比较强，牛人也多一些，您也可以来试试啊

安捷伦色谱专版交流地址：http://wwwinstrumentcomcn/bbs/forum_528htm

液相色谱交流版

http://wwwinstrumentcomcn/bbs/forum_27htm

此外，就是我找到的一些资源，希望能够帮到您啊：

Agilent 1200方法和序列设置中的小技巧

做液相色谱断断续续有8年的历史了，自从买了Agilent 1100，感觉做实验方便得多。无需手动进样，摸好条件后只要设好方法和序列，一点击start，仪器就开始工作了。不只是做样品，还可以包括最后的冲柱子，它都能一次性完成。但是方法或序列设置不当的话，会导致做无用功，全部白做都有可能。下面我来谈谈自己的工作经验和技巧。

1 摸条件 (以C18柱为例)

可以选单针进样模式，将sample info设置好文件名，比如我做肌苷氯化钠注射液的有关物质，可以在前缀上设jglhn，后面自动生成000，第一针一定要走足够长的时间，我是做化学药的，通常走到主峰保留时间的2倍，看看后面是否有杂质峰出现，要保证针与针之间的数据平行必须做到一针出峰干净后再走第二针。在method里设置必要的参数，比如进样量（20μl）、流动相配比（D泵 05%的冰醋酸水溶液）、流速（10ml/min）、柱温（35℃）、检测波长（248nm）、保留时间（45min）等，将摸索好的方法用save as method保存到jg1m。需要说明一点，走单针时文件名自动累加，第一针是000，第二针就自动生成001。

2 设置序列参数

选择序列进样模式，在sequence parameters中设置好第一针的文件名，还是以肌苷氯化钠注射液为例，在前缀上设jglhn，后面自动生成000，把它改为100与单针区别开，免得覆盖！在sequence table中有几个参数是必须设置的，如方法名和进样次数。而瓶号和样品名称是可以不设置的，也就是说可以让仪器只运行方法而不进样，主要用来冲洗或平衡柱子。一个序列中可以包括多种方法，比如做有关物质自身对照法时，低浓度的样品保留时间可以设得短些，假如21分钟出主峰，我就设到24分钟，方法另存为jg2m。

假如我做两个批号的样品，进样和冲洗的设置如下：

瓶号 样品名 方法 进样次数

1 ref1 jg2 3

2 sample1 jg1 3

3 ref2 jg2 3

4 sample2 jg1 3

wash1 1

wash2 1

我们可以看到序列中一共包含14个文件，它们的文件名是jglhn100——113。最后两个文件是不需要出报告的，wash1和wash2代表冲洗柱子程序，比如wash1用A泵（水）冲洗，wash2用A泵（水）-B泵（甲醇）（30：70）冲洗。这样一来，人可以离开，仪器会自动完成全过程。需要注意的是：确保充足的流动相！此外，在sequence information中设置关机程序，选择shut off，standby状态即可。需要说明的是，如果中途停止，按stop，再按 start时文件名被覆盖。如果你需要保留原来的文件，可以重新设置第一个文件的编号，比如200。

3 巧用partial sequence来补针

假如发现有一针结果不理想，需要补进一针或数针，又不想改变原有的序列，就可以用sequence中的partial sequence→run sequence来进行补针。在想要补的文件前面的小方框中打勾，然后运行部分序列即可。

4 实验中出现机械手突然失灵，进样针指示灯变红怎么办？

有时侯时间做长了，机械手会失灵，停止工作，指示灯变红。我最近就碰到过这个现象，解决办法：先将样品室的开关关掉，数分钟后重新开启，并且将样品瓶转移到机械手相对容易抓到的位置，重新设置一下瓶位号。比如19、20号就是比较难抓的位置，需要往里转很大的角度，21、22就相对容易些。

这些是我从实践中摸索到的一点体会和窍门，也许比较简单一些，希望得到大家的补充。

再补充一点：

不要忘了设置装流动相的体积，如果中途添加了流动相，一定要即时更新。虽然是个小的细节问题，忽略的话会带来大麻烦的！

比如如果实际体积是1000ml,你忘了设置，上回剩余的只有200ml,走一段时间后仪器就自动停止了。而如果情况相反也不行，实际只有200ml,你设了1000ml,会导致空气进入色谱柱，严重时无法恢复。当然这后一种情况很少会遇到，只是提个醒。

Agilent1200操作规程

一、1200/化学工作站开机顺序(LAN卡联接)

1 打开计算机，进入Bootp；

2 打开主机各模块电源（不分先后），等待Bootp接收,显示七行数字后,再双击

INSTRUMENT 1 ONLINE 图标,进入 化学工作站；

3 调出一个分析方法，检查各参数的设置；

4 旋开泵上的排气阀，将工作站中的泵流量设到5ml/min，溶剂A设到100%；

5 在工作站中打开泵，排出管线中的气体数分钟；

6 依此切换到B、C、D溶剂分别排气；

7 将工作站中的泵流量设到1ml/min，多元泵则再设定溶剂配比，如A=80%，B=20%；

8 关闭排气阀，检查柱前压力；

9 待柱前压力基本稳定后,打开检测器灯，观察基线情况；

二、数据采集方法编辑

1 由运行控制 进入样品信息…设定操作者姓名，样品数据文件名等。

2 泵参数设定：（以二元泵为例）

1）在流量处输入流量,如1ml/min，在溶剂 B处输入700,(A=100-B) ,也可插入一行时间列表 ,编辑梯度。在最大压力极限处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

2）单击确定进入下一画面。

3 柱温箱参数设定:

1）在柱温下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击更多>>键,选中与左侧一致，使柱温箱的温度左右一致。

2）点击确定进入下一画面。

4 VWD检测器参数设定:

1）在波长下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在峰宽 (响应时间)下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间, 如>01min(2s)。

2）在时间列表中可以插入一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。

3）点击确定进入下一画面。

5 单击方法菜单，选中保存方法，输入一方法名，如“test”，单击确定。

6 等仪器就绪，基线平稳，从方法菜单中选择运行方法，进样。

三、数据处理操作步骤

1 由主菜单上的视图进入数据分析，到数据处理界面；

2 由主菜单上的文件进入调用信号，调出要分析的数据文件色谱图；

3 由主菜单上的图形进入信号选项，调整谱图坐标:

1)点自定义量程，在时间范围中输入横坐标(时间）(例如0到10)；

2)在响应范围:中输入纵坐标(响应值）(例如-50到800)；

3)在量程框中，调到全部使用相同量程；

4)点击确定退出。

4 由主菜单上的积分进入积分事件，设置、修改积分参数；

1)在斜率灵敏度后，输入斜率值；

2)在峰宽后中，输入最小峰宽值；

3)在最小峰面积后，输入最小峰面积值；

4)在最小峰高后，输入最小峰高值；

5)点击左上方带钩的图标，确认；

5 由主菜单上的报告进入设定报告，设置报告参数：

1)在定量结果栏中，选择计算（面积百分比，外标法，内标法等）；

2)在目标栏，选打印机打印，或屏幕打印；

3)点击确定退出。

6 由主菜单上的报告进入打印报告，打印报告；

四、关机

1 关机前，用95%水冲洗柱子和系统05-1小时，流量05—1ml/min，再用100%有机溶剂冲05小时，然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

2 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。

3 关掉Agilent 1200电源开关。

五、注意事项：

1 氘灯是易耗品，应最后开灯，不分析样品即关灯；

2 开机时，打开排气阀，100%水，泵流量5ml/min，若此时显示压力 >10bar，则应更换排气阀内玻璃料。

3流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

4流动相使用前必须进行脱气处理，可用超声波振荡10- 15min。

5配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，进行seal-wash，溶剂不能干涸。

6当使用缓冲溶液时，要用水冲洗手动进样器进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。

Agilent 相关资料整理，有需要的请进

http://wwwinstrumentcomcn/bbs/shtml/20070320/774376/

Agilent 1200 现场培训材料

http://wwwinstrumentcomcn/bbs/shtml/20080703/1337278/

Agilent 1200 LC现场培训教材

http://wwwinstrumentcomcn/download/shtml/114119shtml

安捷伦LC1100/1200的使用技巧和小窍门

http://wwwinstrumentcomcn/bbs/shtml/20090311/1780319/

Agilent1100※1200化学工作站

http://wwwinstrumentcomcn/bbs/shtml/20080503/1246303/

转载：《分析测试百科网》

色谱柱预防性保护与柱寿命的延长

通常，一根色谱柱在分析数千个样品之后性能仍然保持良好，但也有的柱仅分析不多的样品后几乎就报废了。影响柱寿命和其它问题的因素很多，而有些因素是操作者很难控制的，如果被分析的样品（如分析生物样品），怎么净化样品也是“脏”的，好于色谱柱的影响是非常大的。然而采取下列措施后，在多数情况下总能够人为地减少柱上故障，达到延长柱寿命的目的。

1．加流路过滤器和保护柱

流路过滤器紧靠进样阀后面，位于分析柱前。05μm烧结不锈钢片夹在死体积很小的套子中，挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒入柱。因为每个样品都过滤既费事又带来误差，样品量少过滤更困难，因此流路上装过滤器是比较省事的办法。也可以在流路加上保护柱，放在流路过滤器和分析柱之间，或者代替流路过滤器。保护柱的使命是收集阻塞柱进口的来自样品的化学“垃圾”。这程垃圾最终隐藏低柱效能。保护柱应该是小体积，用分析柱的同种填料填装。保护柱使用得当，对分离无影响，好像未装保护柱一样。有些厂商的商品将保护柱都是用短柱、不超过3cm长，内径2～3mm，用较大粒度的填粒（15～20μm）干法填装，会使分析柱的效能有所降低。

2．避免高压冲击

一般色谱柱都能经得起高压，但经不起突然变化的高压冲击。引起高压突然冲击，主要是因样品阀的缓慢转动、泵起动快，柱切换操作等。等面已讨论过，转动六通进样阀时从泵到柱的液流会瞬时切断。在阀的泵侧压力升高，在阀的柱侧压力降低（变化超过20%）。阀转到底后压力突然冲击一下恢复正常，手动进样阀的变化不大，自动进样阀比较慢，可能造成压力冲击，可用氦气代替空气驱动进样阀。因氨压缩系数小。另外泵起动不应过快，可分步操作。如用3ml/min流速，先从1mL/min到2mL/min，然后再3ml/min，每个间隔应大于20s。

柱切换技术的应用也很广泛，切换过程中在色谱柱的入口处压力在零到很大数字之间变化，会很快使柱报废。

3．分离条件

多数色谱柱有很宽的试验条件范围，但具体应用又受到限制，主要是pH值、柱温和流动相的选择。

硅胶为基质的键合相要求pH在25～7之间，极端pH的流动相能“溶解”硅胶，使键合相流失。结果非碱性组分峰变宽。如果一定要用高或低pH的流动相，可加预柱（饱和柱）。预柱装在泵和进样阀之间，用分析柱相同的填料填装，或者用普通硅胶。硅胶饱和了流动相。减少了分析柱填料的损失。预柱不要求柱效高，用价格低的一般硅胶疏松地填装，按期检查硅胶的溶解情况。用预柱也有不利的影响。即新流动相难以平衡，保留时间不稳定或稳定慢。使用了预柱一定要加流路过滤器，以防止硅胶微粒引起的麻烦。

以硅胶为基质的柱和阴离子交换柱超过60℃后，会增加对流动相中化学物质的吸附。在高温下用小颗粒柱引起柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。在4℃以上使用3μm柱，70℃以上使用5μm柱，会使N值降低50%。

有些流动相中的溶剂不能用于某些柱，如小颗粒的聚苯乙烯填料不能用于非水的排阻色谱。另一方面，有些柱与某些溶剂（如四氢呋喃）一旦达到平衡，不要随意改用其它溶剂。有关这些特殊填料，可以参见有关资料。

水溶性流动相会引起微生物生长而造成阻塞柱。色谱柱应存放在纯有机溶剂或加了50%有机溶剂的水中。凝胶柱可存放在水溶性缓冲液中，同时加001%叠氮钠以防止微生物的生长。

4．净化样品

用溶剂溶解的样品，多数组分在一定的时间内能完全从柱中流出来，不会造成危害。

有些样品可能含有微粒物质，样品中的某种组分（如蛋白质）在柱头上沉积下来，组分在固定相上保留很强，溶剂带走柱填料，等等，这些都会造成柱效能下降或柱寿命的影响，有必要采取措施防止柱变坏。

如在光线照射下观察样品是浑浊的或带有乳白色，进样前必须要过滤。虽然流路上装有过滤器和保护柱，但不能代替样品的前处理，样品中过多的微粒会使过滤器和保护柱超载，很快阻塞，或者微粒进入分析柱，所以在进样前必须过滤样品。

若怀疑样品与流动相混合有沉淀而对色谱柱有阻塞，应先试验一下，看样品溶液加入流动相中有无变浑或乳白色出现。如果进样后压力突然增加而后又慢慢减小，表明样品中有微粒或发生沉淀。如有沉淀要设法改变分离条件，包括换样品溶剂和流动相；或处理样品去掉不溶物质。应尽量用小体积的样品。

有些样品能很强地吸附在柱填料上，这样会降低塔板数，改变样品的保留时间、峰形，并且使得基线变差。除了用预处理的方法除去强保留物质外，还要加保护柱，定期清洗色谱柱。有时因为疏忽，用对柱有害的溶剂溶解样品，比如用6mol/L的氢氧化钠溶解样品，这样的样品只要进50～100μL到硅胶基质柱中，硅胶就很快溶解而使柱报废。在这种情况下，应立即中和样品，或除去原溶剂中的有害成分。

5．用强溶剂定期冲洗柱

每次工作结束，用强溶剂冲洗柱是良好的习惯。可用甲醇、乙腈冲反相柱，冲去留在柱上的强吸附组分。用甲醇/水为流动相时也应冲洗。冲洗的程序在以下章节中介绍。

柱头的烧结不锈钢滤片，要求平整，死体积小，孔径适当（2～5μm）。过滤片选择不好会改变色谱峰形，增加阻力或起不到阻挡污染物的作用（填料很快变色）。

此外，对柱硬件的保养也不可忽视。实际操作中应注意以下几点：

1、 接头要配套，用同一厂商的组接件；

2 、接头之间、柱压帽螺母与密封卡磁之间无微粒（填料），否则收紧时容易咬死；

3 、密封卡套与柱管一次性卡紧后再也不能松动，所以拆开柱头再上紧时要小心，不能使卡套移动，原来柱端的不锈钢滤片和垫片的厚度和强度也不能改变（改变这些附件的性能就促使卡套移动）；

4 、接头等组接件不要拧得过紧，适当上紧后接上泵试验，分步拧紧，直到不漏为止。还有非常重要的是柱硬件的损坏往往会造成不可挽回的损失。

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