请问免疫组化如何正确选择和使用二抗

1 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠源性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。目前，美国Vector公司和 Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒，即一抗来源于小鼠，该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封闭内源性小鼠Ig的封闭液，可以 得到清晰的染色背景。

2注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1，可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。

3正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般供应商提供稀释比例从1：10稀释度始，作5倍比稀释。

参考网址on http://wwwbio1000com/zt/experiment/284333html

包埋好的标本用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。经60℃烘片2-8小时（都试过，没啥差别，但非实质性器官应适当延长时间）。二甲苯Ⅰ脱蜡30分钟（若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60℃），二甲苯Ⅱ脱蜡10分钟。梯度酒精复水：100%酒精3分钟，100%酒精3分钟，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟,75%酒精3分钟， 50%酒精3分钟，蒸馏水3分钟，蒸馏水3分钟，PBS 5分钟。进行抗原修复：将切片置于01mol/L且ph=60的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力三分钟至微微沸腾，再用50火力维持7分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。用PBS 3分钟，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（无色的5�S或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液）在湿盒中37℃封闭30分钟（室温30分钟也可）。用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜（37℃1小时多也差不多），再用PBS 3分钟×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加DAPI 避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。用PBS 1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察。

做免疫组化前需要注意的方面：

1、抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重，此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。

2、石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，一般用6min4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。

3、注意检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。

4、抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的speciesreactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。

5、抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min；二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。

6、抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。

一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。

7、血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。

8、细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。

扩展资料：

一、免疫组化的分类：

1、免疫荧光细胞化学技术：将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光，从而可以确定组织中的抗原定位或定量。

2、免疫酶细胞化学技术：是目前免疫组织化学研究中最常用的技术，基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

3、免疫胶体金技术：就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究。由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。

二、免疫组化的原理：

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。

由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

-免疫组化

冰冻切片能做免疫组化，但通常需要双氧水处理。

头天做好，第二天做的话，切片通常有两种保存方案。1 在固定液中过夜。通常是4°保存。 2 水洗后过夜，但这个需要在湿盒中保存，也是4° 。但我个人喜欢1抗后过夜。

主要有： 1磁珠法核酸提取试剂盒

2磁珠法提取DNA试剂盒

3DNA提取试剂盒（离心柱法）

4磁珠法RNA提取试剂盒

5RNA提取试剂盒（离心柱法）

6磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒

7反转录试剂盒

8胶回收试剂盒

9PCR纯化试剂盒

10病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）

11土壤基因组DNA提取试剂盒

12法医样本DNA提取试剂盒（磁珠法）等 1elisa

常见elisa试剂盒有：

特种蛋白检测elisa试剂盒

如免疫球蛋白,抗链O-aso,类风湿因子RF,C反应蛋白,微量白蛋白,β-2微球蛋白human,铁蛋白,转铁蛋白transferrin等等

肿瘤标志物检测elisa试剂盒：

如肿瘤标志物，组织多肽抗原，肿瘤相关因子，胰腺癌，直肠癌，细胞角蛋白片段，胃肠癌，铁蛋白，糖链抗原，神经特异性稀醇化酶，上皮膜抗原，乳腺癌，人抗小鼠抗体，前列腺，甲胎蛋白，肝癌，甲基苯丙胺，大肠癌，肺癌，大小便隐血检测，癌胚抗原，β-2微球蛋白等等。

食品安全检验elisa试剂盒：

食品中的激素、药物、霉菌毒素、过敏原残留、转基因产品的检测试剂盒，以及微生物、维生素等的检测产品。

植物病毒、细菌、真菌、植物激素和转基因作物的农业诊断试剂盒

动植物疾病诊断类如猪、牛、羊、马等家畜和禽类以及宠物类检测试剂盒

传染病检测elisa试剂盒

如幽门螺杆菌,乙脑,乙肝,丙肝,丁肝,戊肝,庚肝,衣原体,性病,腺病毒,微小病毒B19,天疱疮,水痘-带状疱疹病毒,生殖支原体,伤寒,沙眼,腮腺炎,人型支原体,麻疹,轮状病毒,流行性出血热,淋球菌,莱姆病,柯萨奇,抗解尿支原体,军团菌,结核,胶原,尖锐湿疣,甲肝,脊髓灰质炎,急性胰腺炎尿胰蛋白酶,霍乱,呼吸道合胞病毒,肝吸虫,副流感,肺炎,带状疱疹,传染性单核细胞增多症,层粘蛋白,布鲁氏杆菌,百日咳,白喉,艾柯病毒,EB病毒,A族链球菌等等。

2免疫共沉淀试剂盒

3化学发光试剂盒

4免疫组化试剂盒

5放射免疫试剂盒

6免疫荧光试剂盒 1细胞凋亡试剂盒

2葡萄糖检测试剂盒

3支原体检测试剂盒

四、试剂盒使用示例

试剂盒的产生正是为了使实验人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程，所以试剂盒中一般配备有相应的使用说明书，用户按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果。

⑴试剂盒使用说明书

说明书一般包括公司标志及名称、试剂盒名称、试剂盒组成、保质期、使用领域、使用方法等项目

说明书格式如右图所示：

①一般在页眉页脚处为公司的名称及标志；

②接下来为试剂盒的名称；

③试剂盒组成中应为试剂盒中的所有内容，为了简洁明了，一般以表格的形式表现；

④操作步骤是试剂盒说明书中最重要的部分，内容应准确、简洁、易懂，不能包含带有歧义的句子，更不能含糊其辞，排版上操作步骤应将复杂的步骤拆解，使人一目了然。可以说操作步骤为试剂盒的灵魂。 试剂盒内容（以离心柱型为例）：

一般包括：裂解液RL

去蛋白液RW1

漂洗液RW

RNase free ddH2O

吸附柱（RNase free）

过滤柱（RNase free）

缓冲液

离心管（RNase free）

收集管（RNase free）

此外，还配有一份试剂盒使用说明书，根据不同的生产商，可能还配有不同的试剂，如：DNA酶、溶菌酶等。

使用时一定要根据自己的实验需要购买专用提取试剂盒， 如果不是专用试剂盒，或许能提出RNA，但不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RT PCR、芯片分析、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析、分子克隆等后续实验的结果。

当前提取效果好的是QIANGEN公司生产的RNA提取试剂盒，但其售价较高，单次实验费用花费太大，对精度要求不高的实验没有必要购买，当然还有其它的进口试剂盒，但是均存在价格高、订货周期长的问题（如果碰上国内无货的时候，要从国外发货，会等很长一段时间）。普通的提取实验用国产的试剂盒就足以，价格不高，基本上各地均有现货，如天根（目前国内生产的试剂盒中销售面比较广的一种）等，其价格比进口试剂盒要便宜许多，且效果还不错，性价比还可以。

当然，就RNA的提取而言，不一定试剂盒的提取效果就非常好，其实采用一些经典的RNA提取方法，效果也很不错，如：TRIZOL、EDTA等，只是试剂盒使用方便，经典的方法操作复杂一些。

比如一抗是鼠抗人，二抗必须是×抗鼠的。×表示可以是羊，兔，马等。一抗是单抗，二抗是多抗，是抗一类同种异型的Ig，带有特殊的可产生发光现象的标记。

条件允许尽量选择进口，一抗abcam，Santa，CST等值得信赖，二抗的话国产的就行了。

源性一抗如果需要做共定位，那么就需要不同源性的且要能够用于人组织的，可以做组化的，二抗建议选择驴抗，这样用处多；如果说是做组织化学，那么一抗源性就无所谓了只要能用于人的组织，二抗相应配套就行。

扩展资料：

抗体选择没问题，关于二抗你直接购买国产的二抗试剂盒就可以了，如中杉金桥或者博士德的都没问题，里面封闭用的过氧化氢和山羊血清都有的。按照试剂盒说明，一步一步做即可。  

免疫荧光，ABC，westernblotting一抗应该可以通用，

某些抗体的说明书上会给推荐效价，有时会同时给出westernblotting和免疫组化的效价。

一点更正：

免疫荧光就是一种免疫组化方法！免疫荧光使用的是荧光抗体（荧光一抗为直接法，普通一抗加荧光二抗为间接法）。

免疫组化的二抗必须是抗一抗物种的抗原，比如说：做A动物的B蛋白所用的一抗为动物C抗动物A的B蛋白抗体，二抗就应该是动物D抗动物C抗体。

如：豚鼠抗大鼠cofilin1一抗，羊抗豚鼠二抗。二抗远比一抗便宜。

参考资料来源——免疫组化