ES培养基成分

不同的ES配方多少有些差异基础培养基一般用DMEM或DF12（以下为DMEM培养基为例）

1、提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻;

2、在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分(如，丙酮酸钠、抗生素等)，按照比例加入dmem培养基中，作好标签;放入4℃冰箱保存。

ES细胞培养方法：

化冻

将血清(Fetal Bovine Serum，Hyclone)从-20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜;也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存;

灭活

(1) 放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准);

(2) 当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟;若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短(比如：不超过5分钟)，则仍可使用;若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME

胞的培养;

(2) 取出，自然冷却至室温(约需1-3小时)，可分装或-20℃继续冻存;

分装

(1)转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀;吹出血清时要注意：不要吹出气泡(血清很粘稠，很容易产生气泡;如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下);标好批号和日期;

(2)放入-20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。

原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备

1取125-135dpc孕鼠，断颈处死;

2将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫)，剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中;

3 把平皿转入超净台;

4 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);

5 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次;

6 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);

7 加入适量Trypsin-EDTA(025% Gibco 25520，下同)，体积约等于组织块体积;

8 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘)，加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀(5-10次)，静置;

9 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。

10 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);

11 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签(ME-0;注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好)，转入培养箱培养;

12 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次)，若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代(视细胞疏密而定)，放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。

饲养层细胞(Feeder)的制备

注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem)

弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);

放入培养箱培养3小时(2-4小时);

用01% 明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可)，室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止;

弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性);

加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞)，半小时后即可使用(如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上)，可使用6-10天，用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做)。

ES细胞的复苏

提前制备好相应数量的Feeder;

准备37-39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管(冻存细胞)，迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化;

转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟;

弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中(冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿)，补加适量培养液;

转入培养箱培养，次日换液;此后每24小时换一次液，每48小时传一次代(视生长情况)。

ES细胞的换液

1 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内)；

2细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察(判断生长情况，并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;

3 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基(6 cm培养皿约5 mL，35 cm培养皿约3 mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基);

4 放回培养箱继续培养。

ES细胞的传代

前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;

提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内);

将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少;

将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去;再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打(视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来)，滴加补加培养基至5 ml左右(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为35cm培养皿，则补加至3ml左右)，作好标签;

前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。

ES细胞的冻存

常规方法将细胞消化成单细胞悬液;

转入试管，1000转/分钟离心5分钟;

配适量冻存液(为含10% 二甲亚砜(DMSO)，10% FBS的DMEM培养液);

弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液(只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可)，转入冻存管，作好标签;

放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。

即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测

因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。（流式检测荧光病毒感染细胞时加DAPI去死活）

有些抗生素会在一周内降解，培养基最好现用现配。

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。谷氨酰胺脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和能量代谢。在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20℃冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4度冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。

GlutaMAX-Ⅰ是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的a-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-Ⅰ二肽非常稳定，即使在121℃灭菌20min， GlutaMAX-Ⅰ二肽溶液有最小的降解；而在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的，但其在溶液中不稳定，经过一段时间后会降解，确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。因此GlutaMAX-Ⅰ是细胞培养中谷氨酰胺的替代品

与CO2一起形成缓冲系统，保持培养基PH值稳定。

在细胞表面,NRDc能够结合HB-EGF并能促进其诱导的细胞迁移。 NRDc基因敲除的小鼠,大部分在出生后48小时内死亡,神经系统发育滞后。 我们研究发现,NRDc是第一个特异结合组蛋白H3K4me2的蛋白,并且具有调控基因转录的功能。

中文名分散酶II，一种非特异性金属蛋白酶，细胞生物学中常被用来从各种不同组织或器官中消化细胞外基质，释放并制备原代单细胞；或用于细胞培养中的细胞收获或接种转移；也被用于防止悬浮细胞培养时的细胞意外结团。，如原代细胞的分离，细胞传代等。另外，Dispase II还可用于消除悬浮细胞培养过程中发生的细胞聚集。与其他细胞生物学常用蛋白酶（如胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶等）相比，该酶具有以下优势：1）一种快速有效且温和的细胞消化酶，对细胞损伤小，且能维持细胞膜完整性；2）来源于细菌，无支原体或其他动物病毒污染；3）稳定性强，不受温度、pH及血清组分的影响；4）可用于多种类型组织和细胞的分离等。

本品非无菌Dispase II，来源于Bacillus polymyxa，使用时需对其除菌处理，用于细胞培养时常用工作浓度为06-24 U/mL。

是包含蛋白水解酶和胶原酶活性的一种细胞消化液，是胰酶/EDTA消化液的完美替换产品，用于从常规组织培养器皿和粘附培养器皿中消化细胞，消化为单个细胞。与传统的胰酶消化液相比，本品具有以下优势：

1）适用于绝大多数原代细胞和哺乳动物细胞系的消化，以及昆虫细胞；

2）温和有效的消化干细胞（hESCs和mESCs），冻存后细胞具更高复苏率；

3）几分钟内实现粘附细胞的分离，不需清洗或中和反应，节省细胞传代时间；

4）对细胞消化较为温和，能增加细胞产量和存活率；增强细胞贴壁效率；改善细胞形态和细胞生长特性等。

注意事项：Accutase™融化后4℃保存，至少2个月稳定。不可室温保存。也可分装成单次用量，放到-80 ℃冻存，有效期2年。

cGMP mTeSR™1是使用最为广泛的，用于培养人胚胎干细胞（ES 细胞）和诱导多能干细胞（hiPS 细胞）的无饲养层培养基。从iPS的生成、培养到诱导分化，使用mTeSR™1培养细胞均建立了成熟的实验流程；该培养基已在50多个国家成功用于维持上千种ES细胞系和iPS细胞系，应用此培养基的研究成果发表于顶级的多能干细胞杂志，并为干细胞研究人员提供了强大的支持。

mTeSR™1是一款高度专业化、不含血清的完全培养基。mTeSR™1培养基选用的原材料经过严格的预筛选，确保了批次间的一致性，同时为ES 和iPS细胞的无饲养层培养提供稳健的实验环境，这为研究人员提供具有高度一致性的、表型均一、未经分化的高质量ES/iPS细胞培养物提供了保障。

mTeSR1在符合cGMP质量管理体系下生产，确保最高的质量和一致性以及可重复性。

建立体外AGM-S3基质细胞共培养体系,以揭示AGM-S3细胞对终末分化中性

是指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数量的单位。这个单位比“菌落数”更准确地反映问题的实质。理论上，一个活细菌可以在条件合适的固体表面上形成一个菌落，但是吸附于微小颗粒上的两个以上菌体或粘连在一起的菌团可能共同形成一个菌落，而且不同环境因素作用下，细菌的生活能力各不相同，会影响其在该条件下形成菌落的能力，致使形成的菌落数远低于实际的活菌数。因此可用菌落形成单位代替以往常用的“菌落数”作为平板计数的数量单位。

消化试剂。一种无酶试剂，适用于将人胚胎干（ES）细胞或人诱导多能干（iPS）细胞集落解离为细胞聚集体，且无需对已发生分化的集落进行手工挑选。

Matrigel是一种细胞外基质的混合物，其中包含laminin和多种生长因子，用于细胞培养。

基底胶是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，基底胶聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。

用途：培养细胞时可无需稀释直接包被，包被厚度可为05 mm(薄层)或10 mm(厚层)。Matrigel也可以在无血清培养基中稀释后用于包被培养器皿表面，根据细胞类型和应用目的确定相应Matrigel浓度。

温和细胞解离试剂（GCDR）是一种无酶试剂，适用于将人胚胎干（ES）细胞或人诱导多能干（iPS）细胞解离为细胞聚集体以进行常规传代或单细胞悬浮液。它也适用于分离肠隐窝以建立肠道类器官，以及用于在传代类器官培养物时分解康宁®基质凝胶®圆顶。GCDR不含酶或其他蛋白质。

GCDR现在也在经过认证的质量管理体系下按照相关的cGMP制造，以确保可重复结果的最高质量和一致性。

基于最原始的配方，是我们成分明确、一致性高的无滋养层培养基，用于培养诱导多能干细胞（iPSC）。也可用于ESC培养。（ DOI: 101111/cpr13002 ）

人多能干细胞基础培养基，是完全确定的、不含血清和动物源成份的培养基，用于人ES和iPS细胞的分化。它是基于AndrewElefanty博士发表的APEL配方（缺乏不确定的成份，如不含蛋白的杂交瘤培养基）

该培养基可用于贴壁或EB操作流程。 可与多种不同的诱导因子或细胞因子一起使用，支持外胚层，中胚层和内胚层谱系的分化。

它们基本参与了90%以上种类细胞的培养过程。

作为带头大哥，能力非常全面，号称是应用最广泛的细胞培养液。

作为随时紧跟老大MEM的二弟，青出于蓝而胜于蓝，浓度要高出2~4倍，可分为高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。

老三中规中矩，营养成分比较简单，比DMEM少一点糖和谷光甘肽，常用于淋巴细胞的培养。

起初是作为一种无血清配方设计的，常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以I:I结合，称为 DMEM/F12培养基 ，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。

小兄弟F12常用来支持CHO、Hela和L－细胞生长以及原代大鼠肝细胞和前列腺上皮细胞的培养。MEM和F12 这两种培养基各取1/2，即可形成神经生物学最通用的培养基。

完全培养基DMEM加胎牛血清。

小牛血清和胎牛血清的区别：

1、来源不同： 

（1）小牛血清取自出生10－30天的小牛，出生三月龄小牛动脉采血分离血清。

（2）胎牛血清是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清。

2、品质不同： 

（1）小牛血清品质不如胎牛血清。

（2）胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

3、用途与用法不同： 

（1）小牛血清而有些细胞只需小牛血清即可。

（2）胎牛血清某些细胞必需胎牛血清才能生长。

4、外观不同： 

（1）小牛血清外观**澄清，微溶血，有异物稍粘稠液体。

（2）胎牛血清是一种性状，外观浅**澄清，无溶血，无异物稍粘稠液体。

扩展资料

1、牛血清的功能：

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。

（1）提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

（2）提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

（3）有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

（4）是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

（5）起酸碱度缓冲液作用。

（6）提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

2、解冻血清注意事项：避免产生沉淀物

（1）解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃，实验显示非常容易产生沉淀物。

（2）解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生

（3）请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

（4）血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

（5）若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理。欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。但不建议以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

-胎牛血清

-血清

一般配法如下：

一袋粉末是一升的量，你将1升的烧杯洗干净，去离子水清洗，接800ml左右的水量，倒入DMEM粉末，搅拌子搅拌，之后加入37g的碳酸氢钠，调节ph值在72--74之间，个人建议你的ph值偏小一些，因为过滤后培养液的ph值会增加02左右（好像是吧）。调好之后，用量筒定容至1000ml，搅拌均匀即可。

之后就倒入高温灭菌好的滤器，（记得放滤膜喔~）用同样灭菌好的瓶子接收即可。

有什么不懂的可以继续问我~~~~

动物细胞培养液：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清或血浆。

植物组织培养液的成分：水、无机盐、蔗糖、植物激素（生长素，细胞分裂素）等。

干细胞对培养条件要求较高，常用的胚胎肝细胞培养基有mTeSR 1培养基，主要成分有： DMEM、bFGF,EGF、血清、双抗、LIF、谷氨酰胺、二巯基乙醇、非必需氨基酸等

这个我只知道

3动物细胞培养的培养基

糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血浆、血清

还有哺乳动物胚胎培养液

无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清

植物组织培养的培养基中肯定要有植物激素、微量元素

至于其他的不要求掌握额