神经元与胶质细胞共培养用什么培养基

神经元与胶质细胞共培养用什么培养基

培养基的选择：

细胞培养是实验室里最常见和最基本的实验了，但却不是最简单的。别小看细胞培养，这里可蕴含着大学问。有时候细胞状态不好，转染、药筛这些实验根本就没办法做。影响细胞培养的因素很多，让我们先从培养基和血清说起。

◆ MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及浓度。

◆ 改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。

◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。

◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。

◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。

准备几种培养基，然后花大约两周的时间做一个简单的细胞生长实验，来选择其中最适合的。

以前大部分实验室都是用干粉培养基，但配制过程就较为繁琐，要溶解、调pH值，过滤，过程中可能会产生一些浓度误差，而且有些实验室的水质并不理想，所以培养的效果会有差异。

纵观整个百年现代生物技术的发展历史，体外动物细胞培养可以说是支撑现代医学的核心技术。从最初的细胞仅能在体外存活几个小时，到可以连续增殖以供基础医学研究，自至今天成为“细胞工厂”为人类生产重组药物，再到未来也许可以被充分调控分化以细胞本身作为药物，可以说整个细胞培养技术的进步则代表了生物医学的发展方向。

由于动物体内的组织液和血液等为组织细胞的生长提供了充分的营养，因此体外细胞培养过程中营养液的合理提供，将是细胞培养能否成功的第一步关键因素。

本文将结合生物医学的发展阶段，简要阐述动物细胞培养基的研发历程。

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1882-1907：破晓

1882年，Sydney Ringer开发出一种盐溶液，可以让离体的青蛙心脏保持跳动，这也就是Ringer平衡盐溶液（Ringer’s solution）。这被认作是第一次实现动物组织的体外培养。

Ringer成功实现组织的体外培养后，研究者开始聚焦细胞的体外培养。然而，细胞通常很难存活并且几乎没有分裂的迹象。直到1907年，Ross G Harrison利用青蛙淋巴囊分离的淋巴液培养青蛙神经纤维，发现其在数周时间内持续生长。该实验被认为是动物细胞体外培养的开端。

1907-：天然培养基

Alexis Carrel是一名法国外科医生和生物学家、生物学家，因为对血管结构的研究和血管/器官移植的研究获得1912年诺贝尔生理学或医学奖。

Alexis Carrel对组织培养的贡献巨大，他发明了一种直到今天仍在广泛使用的细胞培养瓶的原型瓶，并建立了一整套的无菌操作技术。

Alexis Carrel， 1873-1944

受Harrison成功培养神经纤维的影响，Carrel在1909年派下属Montrose T Burrows到Harrison处（耶鲁大学）学习。在耶鲁大学，Burrows发现淋巴液不适合培养恒温动物的细胞，于是改用血浆代替。

从此，血浆成为细胞培养的主流培养基。Burrows成功的培养了鸡胚细胞和动物细胞。1912年，Carrel证明通过周期性更换培养基可以实现鸡胚胎结缔组织的长期培养（长达几个月），1913年，Carrel发现通过添加胚胎提取物可以极大刺激鸡胚心脏成纤维细胞的增殖并大幅延长存活时间。同时，由于淋巴液、血浆、胚胎提取物的成分未知，研究者开始研究哪种成分影响了细胞的存活和增殖。

1911-：合成培养基的努力

1911年，Margaret R Lewis和Warren H Lewis夫妇证明：在Locke平衡盐溶液加入额外的氨基酸、肉汤、葡萄糖后改良而来的Locke–Lewis solution，可以更有效的促进鸡胚细胞的生长。

他们指出，葡萄糖的作用非常重要，如果浓度不足，细胞就会在几天内萎缩和死亡。同时有研究人员证实了氨基酸和谷胱甘肽在鸡胚成纤维细胞培养中的作用，假说认为谷胱甘肽维持了氧化还原环境。

Joilannes P MVogelaar和Eleanor Erlichman发现了胰岛素、甲状腺素的重要作用，通过加入这两种激素以及葡萄糖、血浆、蛋白胨等到Ringer平衡盐溶液中，可以培养人成纤维细胞3个月以上。再如Baker培养基包含微生物A、维生素C、维生素B1、维生素B2、谷胱甘肽和血浆等。所有这些研究都使用了天然成分。

1940-：细胞系的诞生

1940年，Wilton R Earle等人成功得到了永生的鼠成纤维细胞（L cells）；1951年，George O Gey和同事成功从宫颈癌患者分离得到了无限分裂的人细胞系（Hela cells）。

有了这些细胞系，就不再需要每次试验都进行细胞的分离，而使用同样的细胞系进行试验。这也为衡量不同培养基组分对细胞的微小影响并进行定量分析带来了可能。从此刻开始，培养基的研究取得了快速的进展。

▲海瑞塔·拉克斯 Hela细胞系来源

1946-：基础培养基和无蛋白培养基

Fischer将血浆中低分子组分分离出来，发现去除低分子的血浆不能很好的维持细胞生长，随后Fischer发现氨基酸是低分子组分中维持细胞生长的必要成分。

1955年，Harry Eagle采用Fischer的方法，确认低分子组分中13种氨基酸和8种维生素是必要成分。在此基础上，Eagle发明了minimum essential medium (MEM)培养基，包含葡萄糖、6种无机盐、13种氨基酸、8种维生素和透析血浆。此培养基正式揭开了细胞培养基的研究序幕，直至今日仍然广泛应用于相关领域。

在Eagle的基础上，Renato Dulbecco、Marguerite Vogt、Clifford P Stanners、Norman N Iscove及Fritz Melchers等针对不同细胞系、不同培养目的对MEM培养基进行了优化。Dulbecco进一步优化的dulbecco's modified eagle medium （DMEM）成为目前基础研究中应用最为广泛的培养基，是所有生物制药工程细胞用培养基的研究基石。这位意大利后裔的美国人基于在肿瘤病毒上的出色研究获得了1975年的诺贝尔医学或生理学奖。

在随后的1957年中，美国科罗拉多大学Dr Theodore T Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得一株上皮贴壁型细胞，这就是此后成为生物制药上最广泛使用的CHO细胞。

毫不夸张地讲，没有Eagle、Dulbecco和Theodore T Puck三人在1950年代的共同研究成功，今天全球接近1000亿美金的抗体药物产业化只能是纸上谈兵。

▲In 1973 ，Columbia University wawarded Louisa Gross Horwitz Prize to Harry EagleRenato DulbeccoTheodore Puck

1970-：无血清培养基的开发

1976年，三篇关键的研究文献报道加速了无血清培养基的研究：

Ham研究团队发现了亚硒酸盐的必要性

Larry J Guilbert和Iscove发现除了亚硒酸盐，转铁蛋白和白蛋白是很好的血清替代物

Izumi Hayashi和Gordon H Sato发现几种激素和生长因子的组合是很好的血清替代物

在这几项研究的推动下，以亚硒酸盐、转铁蛋白、白蛋白、激素、生长因子替代血清，多种无血清培养基被开发出来。

在无血清培养开发的同时，研究者也将几种必要组分直接组合成血清替代物，如胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸盐组合成ITS。

Hiroki Murakami等人发现乙醇胺对于杂交瘤细胞培养是必要的，因此与ITS组合成ITES。针对不同细胞，研究者开发出对应的血清替代物。如B-27添加物用于神经细胞培养的血清替代物。

1978-：细胞培养基的工业化应用

1982年，首个基因工程药物胰岛素获批上市，开启了重组蛋白药物的时代。EPO、干扰素β、单克隆抗体等由于具有糖基化修饰，只能采用动物细胞来表达。NS0、CHO细胞成为工业界生产蛋白和抗体药物的主流。

国际上，跨国药企的培养基通常根据产品进行优化，得到特定的培养基。国内由于市场小，研发投入小，通常采用商业化的目录培养基，个别企业如天广实、复宏汉霖、药明康德等进行培养基的自主研发。

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赛默飞世尔科技在全球生物制品研发和生产领域的实力毋庸置疑，尤其是旗下的Gibco™ 品牌，在细胞培养研究及应用领域更是取得了不可估量的成就！

Gibco™ 成立于1962年， 所以要算年纪的话，他已经是个不折不扣的“大叔”了。但这个大叔可不简单，在过去的55年时间里，他取得了许多举世瞩目的成就！

▲Gibco的前世今生

2015年CD FortiCHO培养基新升级为Dynamis培养基，保持CD FortiCHO培养基营养高度富集的特点，且使用方便性及稳定性进一步提升。适用于CHO-K1，GS CHO, CHO S等生长旺盛细胞培养。

MC3T3-E1成骨诱导培养基的配方如下。1准备含10%FBS的α-MEM培养液。

2在备好的α-MEM培养液中添加50μM抗坏血酸,10mmβ-磷酸甘油和100nm地塞米松。

3准备6孔培养板，将P4细胞按照5×103个/平方厘米的规格接种于原始α-MEM培养液中。

4待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成骨诱导培养液。

5每三天换液一次，细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色。

成骨诱导培养液用高糖。

1、成骨诱导分化培养液( 用高糖DMEM 配置的完全培养基、01μmol /L 地塞米松、50μmol /L 抗坏血酸、10mmol /L β － 磷酸甘油)

2、成脂诱导分化培养液( 用高糖DMEM 配置的完全培养基: 1μmol /L 地塞米松、200μmol /L 吲哚美辛、10μg /ml 胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤) ，每4 天半量换液，连续诱导3-4 周" 。

3、成软骨诱导分化培养液DMEM无血清培养基，诱导剂包含：地塞米松0．1μmol／L、牛血清白蛋白（1．25 mg／m1)、维生素C(37．5μg／m1)、丙酮酸钠(1 mmol／L)、TGF—B(1Ong／ml)、β-FGF(1ng／m1)、ITS(6．25 pg／ml牛胰岛素、625μg／ml转铁蛋白，若只做科研加双抗安全一点。

EMEM是最低必需培养液（Eagle"s minimum essential medium )

DMEM是在其基础上增加了各成分的用量，又可分为高糖型（葡萄糖含量4500mg/l使用与生长较快，附着性差的肿瘤细胞，例如杂交瘤中骨髓瘤细胞，DNA转染的细胞等培养）和低糖型（葡萄糖含量1000mg/l)。

DMEM是EMEM的改进版，相对EMEM，DMEM含4倍维生素和氨基酸，2到4倍葡萄糖，另外还额外添加了铁和酚红。