细胞冻在-80冻和液氮冻的区别

一般认为现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，而这些技术的发展几乎都离不开细胞培养技术，特别是医药领域的发展，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用，而细胞冻存又是细胞培养不可或缺的一步。

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术，它一般包括复苏、传代及冻存，这里增添了驯化的步骤，主要是为了得到我们需要的目标细胞，如将贴壁细胞驯化为可悬浮培养的悬浮细胞等。

通常情况下细胞实验周期较长，所以总免不了要冻存一部分细胞以备后用，那我就来说下冻存时的操作步骤和注意细节:

细胞冻存

1、为什么要进行细胞冻存？

细胞培养过程会出现污染或者有些细胞经长期传代培养后可能被诱导分化，而这时之前冻存的细胞就是重新来过的“火种”，避免全军覆没的危险；同时细胞冻存还能节省实验室空间、经费及时间成本；最重要的是确保实验的一致性和连贯性。

2、保护剂的分类？

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞外形成冰晶会因为脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱；如细胞内冰晶形成较多会造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

图 有无细胞外冰晶形成（左：有；右：无）

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。在细胞冻存的过程中用来保护细胞而添加的保护剂一般分为渗透型如甘油、二甲基亚砜（DMSO）或甲醇等，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内冰晶的形成，从而减少对细胞的损伤。另一种是非渗透型的保护剂剂，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖等，可保护细胞免受伤害，提高细胞活率。

3、细胞冻存要什么？

超低温冰箱或液氮罐

025%胰蛋白酶

20%以上血清的完全培养液或血清

DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒)

专用细胞冻存管，程序降温盒

吸管、离心管、喷灯、冻存管架

4、细胞冻存怎么做？

图 细胞冻存

细胞收集

贴壁细胞：选择处于对数生长期的细胞，将培养瓶中的细胞培养液去掉，用025% 胰蛋白酶消化。去掉胰蛋白酶后加入适量培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液后离心。

悬浮细胞：直接将细胞收集到离心管后离心

保护剂添加

去上清，加入含20%以上小牛血清的完全培养基或血清，于4℃预冷15分钟后，加入10%的DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装于细胞冻存管，细胞浓度为3×10^6～1×10^7cells/ml之间。将装有细胞悬液的冻存管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记。

细胞冻存

细胞冻存一般是慢冻：先将冻存管置入置于4℃ 30-40 min，再转入-20℃ 2h后，再放入-80℃冰箱冷冻过夜后保存到液氮罐中。

图 Genever冻存管及程序降温盒

目前更多使用程序降温盒，将细胞冻存管放于盒内，直接置于超低温冰箱，程序降温盒可控制每分钟下降1℃。

1拧开冻存盒；2抽出支架；3加入异丙醇；4支架放回冻存盒中；5放入冻存管；6拧好盖子放入-80℃冰箱保存4h。

05、渗透型保护剂的配置

冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

无血清细胞冻存液如Corning KM Banker II，属于即用型细胞液可直接冻存于-80℃冰箱而无需程序性降温。无血清细胞冻存液不含血清，只含DMSO、葡萄糖等营养成份，大大降低了动物血清来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险，且冻存液成分和配比明确，批次间差异很小，能够保证生长细胞状态的稳定性，细胞存活率高。

一、细胞及培养

1． Marc145细胞

上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。

2． 生长培养基

DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋

５％～10％新生牛血清+ 1％双抗（青霉素和链霉素）的培养液。

3． 冻存液

生长培养基＋10％ DMSO

4． 细胞健康生长的几项注意事项

1）细胞没有支原体等外源因子的感染。

2）培养液的pH值可在70－73，以72为佳。

3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－15×105cells/ml，48hr后长成单层。

4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。

5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。

6）细胞传代时消化液用025％胰蛋白酶+003％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。

二、病毒感染、维持和收获

转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。

维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。

pH应为74～78；后期维持pH会慢慢降下来。

细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。

第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。

收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。

三、细胞病变（CPE）

细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图1是长成单层的marc 145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。

图1 健康的Marc145细胞

图2

图3

图4

图2、图3和图4均是出现CPE的Marc 145细胞

四、PRRS病毒在细胞中增殖规律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）

PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20－22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅55％的细胞呈PRRSV阳性（PRRSV-positive）。第二阶段：感染后的2－3天（也称为病毒的对数感染期），病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出现了感染细胞群。 感染过程如图5所示。

对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如005virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。

图5 荧光抗体染色显微法观察PRRS病毒感染Marc 145细胞过程，A指PRRS病毒感染24hr，B和 C指PRRS病毒感染后42－46hr，D指PRRS病毒感染后72hr。

只要是温度不是很高，对冻存液的成分没有破坏作用，也就是说没有改变冻存液的理化性质，那就完全可用。

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

1984年，HUVEC细胞株由Hiroyoshi Hoshi、Wallace LMckeehan从一段长约10-20cm的人正常脐带静脉中获取、建立。

SetsukoShioda等人研究发现，HUVEC细胞株18-30代的倍增时间为235个小时，24-27代的倍增时间为67个小时，27-30代的倍增时间为84个小时，32-34代的倍增时间为100个小时。培养至40代后，细胞形态出现多样化，有些细胞变大或变小，有些细胞出现多核；细胞密度下降、倍增时间延长。最后细胞在第54代停止生长，ATCC的预期寿命也显示在50-60代。

2018年，Setsuko Shioda等人发现HUVEC细胞株（passage 31）在贴壁汇合时细胞与细胞之间存在间隙，这与典型的内皮细胞特征有所不同。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4 mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm器皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞冻存

冻存条件

60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO，液氮储存

推荐海星HyCyte™一步冻存液(即用型、无血清、无需程序降温)

1 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻存管中。一般冻存密度为(10~20)×106个/mL。

    注意: 细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请将细胞放置于4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

     注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

培养基： 内皮细胞培养基础培养基＋5% FBS＋1%内皮细胞培养添加剂+1% P/S

推荐传代比例： 1:3-1:4，每2-3天换液一次

培养条件： 气相：95%空气+5%CO₂，温度：37℃

细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1 预热完全培养基、胰酶、PBS

2 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

3 加2ml消化液（025%Trypsin-053mM EDTA 货号: GUTP-R001）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

4 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

5 将细胞悬液按1：2到1：4的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

1 该细胞为有限传代细胞系，在体外培养可传20代。请注意代次控制。

2 该细胞培养难度较高，建议使用专用培养基。

3 永生化的人脐静脉内皮培养体系： 内皮细胞基础培养基＋5% FBS＋1%内皮细胞培养添加剂+1% P/S。

推荐使用海星人脐静脉内皮细胞完全培养基，货号：TCH-G406。

4 如选择使用其它品牌培养基，可选：

（1） 内皮细胞基础培养基推荐：ScienCell（CatNo1001）

基本成分介绍：永生化的人脐静脉内皮培养体系是专门为血管内皮细胞体外培养设计的最适于其生长的完全培养基。包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5%)。该培养基的配方能够选择性的促进正常血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态。

（2） 胎牛血清推荐：HyCyte™干细胞预筛选胎牛血清 （CatNoFBP-S001）

基本成分介绍：适用于有较高要求的细胞和较难获得的细胞，如血管内皮细胞。

（3） 内皮细胞培养添加剂推荐：ScienCell（CatNoSC1052)

基本成分介绍：内皮细胞培养添加剂(ECGS)是一种从牛脑垂体提取的培养基补充剂，含有培养血管内皮细胞所必需的生长因子、激素和蛋白质。该补充剂最大限度地促进永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的生长，该因子的添加对维持永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）形态至关重要。

（1）请务必使用以上两种推荐培养体系进行永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养，否则可能导致细胞无法增殖。

（2）T25瓶细胞由于运输过程影响细胞会分泌产生的少量小黑点，不是污染问题，属正常现象，使用专用培养体系进行培养后黑点会逐步减少。

（3）永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）对血清的品质要求较高，请使用高品质胎牛血清进行培养。如细胞状态欠佳，建议将胎牛血清的浓度提高到10%。

不含血清及动物来源性蛋白，能减少各类病毒、霉菌和支原体等的污染，确保冻存细胞安全

成分明确，批次间差异小

既适用于一般细胞的冻存，也适用于无血清培养细胞的冻存

无需程序降温，可直接放置-80℃冰箱长期冻存，操作简单

可培养板整板冻存，例如杂交瘤细胞的冻存，省时高效

参考链接：无血清细胞冻存液对比含血清细胞冻存液的优势

作为一种常见的妇科肿瘤，卵巢癌的发病率在女性肿瘤中排名第五位。COC1细胞作为一类人卵巢表皮癌细胞，是广泛应用于卵巢癌相关研究的细胞系。COC1细胞的培养条件及传代冻存技术已经成为了许多肿瘤研究者关注的焦点问题，下面我们将对相关问题展开讲解。

一、COC1细胞的培养条件

11 细胞培养基

COC1细胞常用的细胞培养基是DMEM/F12和RPMI-1640，在加入10%胎牛血清之后用1%的抗生素溶液进行稀释。其中，DMEM/F12是一种混合型培养基，比较适合培养上皮细胞，RPMI-1640则是一种适用于淋巴细胞的培养基。这两种培养基中都包含有丰富的营养成分和生长因子，能够维持细胞的正常生长。

12 细胞培养温度

COC1细胞生长的最适温度一般在37℃左右，要保持恒定的温度，避免大的温度波动。

13 细胞培养湿度和CO2浓度

COC1细胞生长的环境需要具有高度的湿度和适宜的CO2浓度。常用的CO2浓度是5%，配合高湿度能够提供细胞所需的稳定环境，同时可保证培养基中的PH值稳定。

14 细胞分离和传代

COC1细胞的传代需要注意细胞的分离和培养条件。当细胞生长到70%-80%时，可用005%的胰酶将细胞从培养板上分离下来。分离后需要迅速转移入新的培养板或离心管中，并加入适量的培养基以维持细胞的正常生长。

二、COC1细胞的传代和冻存技术

21 细胞传代

COC1细胞的传代是指将已经培养好的细胞分离培养成新一代的细胞。在传代过程中，需要注意细胞密度的适应、培养基、生长因子的添加和细胞分离等问题。细胞的适应过程中需要一定的时间，不能过快地进行下一代细胞的培养。

22 细胞冻存

COC1细胞的冻存有两种方式，一种是液氮冻存，一种是液氮低温冷冻。液氮冻存是指将细胞冻放于液氮中，以贮存较长时间的细胞；而液氮低温冷冻则是将细胞通过添加冷冻保护剂，使细胞在冷冻后可以存储一定时间。

在细胞冻存过程中，需要注意细胞密度、培养基配方、冻存器的类型和保护剂等问题。保护剂的添加直接影响了细胞冻存后细胞存活率的高低。常用的保护剂有DMSO、甘油、乙二醇等，这些保护剂的运用需要在实验前进行充分的实验验证，保证细胞冻存状况的安全和可靠。