1 微生物菌种保藏的基拳原理
菌种保藏主要是根据微生物生理生化特点， 人工
创造条件， 使微生物代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑
制的休眠状态， 即采取低温、 干燥、 缺氧 3 个条件， 使
菌种暂时处于休眠状态。 一种好的保藏方法首先应能
长期保持菌种原有的优良性状不变， 同时还需考虑到
方法本身的简便和经济， 以便生产上能推广使用[ 妇 。
2 微生物菌种的保藏方法
2 ． 1 定期移植法
亦称传代培养保藏法， 包括斜面培养、 穿刺培养、
液体培养( 保藏厌氧细菌用) 等。 将菌种接种于适宜的
培养基中， 最适条件下培养， 待生长充分后， 于 4 ～
6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养。 保藏时
间依微生物的种类不同而不同。
此法操作简单， 但保存时间短， 需要经常移种， 易
于变异。只能作为菌种的短期保藏。
2 ． 2 液体石蜡保藏法
亦称矿物油保藏法。选用优质化学纯液体石蜡，
采用以下两种方式进行灭菌：①1 2 1℃湿热灭菌
3 0 m i n ， 置 4 0℃恒温箱中蒸发水分， 经无菌检查后
备用。②1 6 0℃干热灭菌 2 h ， 冷却后， 经无菌检查后
[ 收稿 日期] 2 0 0 9 — 0 3 — 1 3
作者简介 董 昧 ( 1 9 7 8 - ) ， 女， 助工， 从事菌种选育工作。
备用圆。把液体石蜡注入已长好菌的斜面上并高出斜
面顶端 1 c m ， 使菌种与空气隔绝。将试管直立， 置低
温( 4 ～6℃)干燥处或室温下保存。 保藏期间应定期
检查， 如培养基露出液面， 应及时补充无菌的液体石
蜡。 。
此方法简便有效， 保藏时间2 - - ~ i 0年， 可用于丝
状真菌、 酵母、 细菌和放线菌的保藏。 特别对难于冷冻
干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的
担子菌等的保藏更为有效。缺点是必须直立存放， 占
空间大， 不便携带嘲 。某些以石蜡为碳源， 或对液体石
蜡保藏敏感的菌株都不能用此法保藏闯 。
2 ． 3 沙土管保藏法
取 6 0 ~ - - 8 0目河沙， 用吸铁石吸去铁质， 用 1 0 ％ 盐
酸浸泡 2 4 h 后弃盐酸， 用水洗至中性， 将沙子烘干备
用。 取地面下4 0 - - - , 6 0 c m非耕作层贫瘠且粘性较小的
土， 研碎后 1 0 0目过筛并用水洗至中性， 烘干备用。 将
处理后的沙、 土按质量比2： 1 混合。 混匀的沙土分装
入安瓿管或小试管中， 高度为 1 a m左右， 塞好棉塞，
1 2 1℃湿热灭菌 3 0 m i n ， 无菌检验合格后方可使用。
把制备好的菌悬液分装每支沙土管0 ． 5 m L ，放线菌
和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 塞好棉塞放入
盛有干燥剂的容器中， 用真空泵抽去水分。抽检合格
后封口， 存放于低温( 4 - - ． , 6℃) 干燥处保藏， 每隔半年
验证 1 次。
本法方法简便， 设备简单， 适用于产孢子和有芽
孢的菌种保藏， 可保存两年， 但对营养细胞不适用。 由
于在真空干燥过程中，机械力容易造成孢子的死亡，
因此在保藏放线菌和部分真菌的孢子时最好用干法
接种闯 。
2 。 4 真空冷冻干燥保藏法 第 7期 董 昧： 微生物菌种保藏方法 ． 3 5 -
2 ． 4 ． 1 好氧茵冷冻干燥管的制备
安瓿管用 2 9 6 盐酸浸泡过夜，用 自来水冲洗并用
蒸馏水浸泡至p H中性， 烘干后加入脱脂棉塞， 灭菌备
用。 保护剂可选择血清、 脱脂牛奶和海藻糖等。 将培养
好的茵体或孢子加入保护剂制成菌悬液， 分装于安瓿
管中， 每支 0 ． 2 m L 。然后放入冰箱冷冻 2 h以上， 达
到一 2 0 ～3 5℃左右。再置于冷冻干燥箱内进行冷冻
干燥直至其中水分被抽干， 时间一般为 8 - - - 2 0 h 。将
安瓿管在真空条件下熔封， 低温或常温保藏。
2 ． 4 ． 2 厌氧茵冷冻干燥管的制备
主要程序与需氧茵操作相同， 注意保护剂的选择
和准备，保护剂使用前应在 1 0 0℃的沸水中煮沸
1 5 m i n左右， 脱气后放入冷水中急冷， 除掉保护剂中
的溶解氧。
此法为菌种保藏方法中应用最广泛的， 是国际菌
种保藏机构通常采用的方法之一， 几乎所有的微生物
均可采用此法保藏。适用于菌种长期保存， 一般可保
存数年至十余年翻。方便之处在于因冷冻干燥管无需
低温保藏， 所以运输方便， 但此法所需设备要求高， 操
作复杂， 费用昂贵。
2 ． 5 冷冻保藏法
2 ． 5 ． 1 普通冷冻保藏技术( _ 2 0℃)
将培养好的固体或液体菌种用橡胶塞封口， 置于
普通冰箱中保藏。 这一方法虽操作简单但不适宜长期
保藏。
2 ． 5 ． 2 超低温冷冻保藏技术( - 6 0 ～ - 8 0℃)
将生长至对数生长中后期的微生物细胞， 加入新
鲜培养基使其悬浮，然后加入等体积的2 0 ％ 甘油或
1 0 ％~ - -甲基亚砜作为冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻
管或安瓿管中， 于 - 7 0℃超低温冰箱中保藏。若干细
菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏 5 年而活力不
受影响。
2 ． 5 ． 3 液氮超低温保藏法
主要程序与超低温冷冻保藏技术( 一 6 0 ～一 8 0℃)
相同。 需注意分装好的安瓿管在放入液氮前需用控速
冷冻机预冻，冷冻速率以 l℃／ m i n为宜，冷冻到
一
3 5℃。如果无控速冷冻机， 可将安瓿管置于- 7 0℃
冰箱中冷冻4 h ， 然后迅速移入液氮罐中保存。使用
时从液氮罐中取出， 立即放置在 3 8 " ' 4 0℃水浴中使
其溶化， 而后直接将其接种到适宜的培养基中即可。
此法存活率高， 稳定性强， 保藏时间长， 是长期保
藏菌种的最好方法。适用于各种菌种的保藏， 特别适
用于难以用真空干燥保藏等方法保藏的菌种翻。此法
需定期向液氮罐中补充液氮，以保证液氮罐中的温
度。
杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。
在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。
淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。
1、动物免疫
(1) 抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
(2) 免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。
(3) 免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞
融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。
表6-1 不同免疫抗原的免疫程序
免疫原特性 抗原量 接种次数 间隔时间 单抗的特性 抗体滴度 亲和性
免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等） 106-107个细胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至强
免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或强
免疫原性弱 A20-400ug 2-4 随后 2-3 每月 2-3月中等 强
B10-50ug 其后 200-400ug 2 其后 4 每月 每天 中等 中等
C10-100ug 2 其后 4 其后“休息” 最后加强 每月 10天 1-2月
中等 中等或强
体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此，针对这些情况，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原05-5ug/ml，细胞抗原105-106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；在37℃，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
2、细胞融合
（1） 主要试剂的配制
a、 细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（022um），分装，4℃保存。
"不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml
100×LG溶液1ml
双抗溶液1ml
75% NaHCO3溶液1-2ml
HEPES溶液1ml
"不完全DMEM培养基：DMEM 1337g
超纯水或四蒸水980ml
NaHCO3 37g
双抗溶液10ml
100×LG溶液10ml
用1N HCl调试PH至72-74，过滤除菌，分装4℃保存。
"完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml
小牛血清15-20ml
用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。
"HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml
HT贮存液1ml
"HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml
HT贮存液1ml
A贮存液1ml
b、 氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L） : 称取176mg氨基喋呤（Aminopterin MW 4404），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 05ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：16×10-3mol/L): 称取1361mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 1361)和388mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 2422)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。
d、 L-谷氨酰胺（LG）溶液（100×，02mol/L） : 称取292g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 14615），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
e、 青、链霉素（双抗）溶液（100×）: 取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
f、 75% NaHCO3溶液 : 称取分析纯NaHCO3 75g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。
g、 HEPES溶液（1mol/L）: 称取2383g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 2383）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。
h、 8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）: 称取200mg 8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW 1521），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。
g 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉05g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH68 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。
h 镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。
i、 50% PEG: 称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，06ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许75% NaHCO3调PH至80，或购买Sigma或Gibco公司现成产品。
⑵ 髓瘤细胞的准备
融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。
骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：
a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。
b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。
c、 1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。
e、取骨髓瘤细胞悬液，加04%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液01ml加入09ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2
⑶ 脾淋巴细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏（也可用注射器内芯挤压脾脏），使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-25×108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。
⑷ 饲养细胞（Feeder cells）的制备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。其制备方法如下：
按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。通常对巨噬细胞来说，96孔培养板每孔需2×104个细胞，24孔板每孔需105细胞。每只小鼠可得3-5×106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞，这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔01ml（相当于2滴），然后置37℃ 6% CO2的培养箱中培养。
⑸ 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的程序已报道的有很多种，这里介绍的是作者所在实验室常用的一种。
A、将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。
B、 1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。
C、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。
D、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40℃的50% PEG（PH 80）1ml，边加边轻轻搅拌。
E、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基；20-37℃静置10分钟。
F、 1000r/min 5分钟；弃去上清。
G、 加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
H、分装96孔细胞培养板，每孔010-015ml；分装24孔板，每孔10-15ml；然后将培养板置37℃，6% CO2培养箱内培养。
I、 5天后用HAT培养基换出1/2培养基。
J、 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。
L、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
3、杂交瘤细胞筛选
杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。
下面简要介绍几种常用的抗体检测方法：
⑴ 免疫酶技术
免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
A、器材和试剂
a 包被缓冲液：
碳酸盐缓冲液：取02mol/L Na2CO3 8ml，02mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至96。
Tris-HCl缓冲液（PH80，002mol/L）：取01mol/L Tris 100ml，01mol/L HCl 584ml混合，加蒸馏水至1000ml。
b 洗涤缓冲液（PH72的PBS）：KH2PO4 02g，KCl 02g，Na2HPO4"12H2O 29g，NaCl 80g，Tween-20 05ml，加蒸馏水至1000ml。
c 稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）01g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d 酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水1783ml，滴加浓硫酸（98%）217ml。
e 底物缓冲液（PH50，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取02mol/L Na2HPO4 257ml，01ml/L柠檬酸243ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f 底物使用液：
OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 015ml。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）10ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 05mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
g 抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
h 抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i 酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。
j 细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。
k 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。
l 酶联免疫阅读仪；或光镜。
m 吸管、加样器及水浴箱、离心机等。
B、 可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）
a 纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。
b 以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。
c 弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。
d 每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。
e 洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。
f 每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。
g 加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。
h 加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分钟。
i 以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
j 结果判定：以P/N≥21，或P≥N 3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
C、 全菌抗原的ELISAS
a 新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。
b 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（01mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
c 步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
d 洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
e 以下步骤同上法。
D、 用全细胞抗原的ELISA
a 按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。
b 淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加083%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。
c 每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。
d 以下步骤同上法。
E、抗体捕捉ELISA试验
本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：
a 以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃ 2小时或4℃过夜。
b 洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃ 1-2小时。
c 洗涤后加适量的抗原，37℃ 1-2小时。
d 洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃ 1-2小时。洗涤后加底物显色，判定结果。
液氮
小 氮即液态氮气，分子量28013，相对密度08081(-1958℃ )，密度12507kg／m3(在0℃，l大气压时)，熔点-20986℃，沸点-1958℃，临界温度-14705℃，临界压力339Mpa (335大气压)，临界密度031公斤／公斤，液态密度08l公斤／公斤(沸点)，蒸发潜热16119千焦耳／公斤，定压比热1034千焦耳／公斤·℃；热传导率228×10-4焦耳／厘米·秒·℃。 为无色透明、无味、无毒之低粘度的透明液体，不导热导电，不自燃助燃，化学性质稳定，不与任何物质起化合作用。 1单位体积的液氮可产生约650倍体积的氮气，氮气是空气的主要组成部分，在空气中的含量高达78％(体积)，液氮作为空气液化分离的最大宗产品、工业制氧的副产品， 一般纯度达99．99％。液氮在常温下很容易气化，保存困难，运输携带也较麻烦，在无液氮生产的地区，应用受到限制。
液氮是一个较为方便的冷源，因液氮特有的性质，已逐步受到人们的重视和认可，在畜牧业、医疗事业、食品工业、以及低温研究领域等方面得到越来越普遍的应用。在电子、冶金、航天、机械制造等方面应用不断拓宽和发展。
一、在畜牧业方面的应用
1、广泛用于家畜冻配改良技术
在多种家畜中，牛的精液冷冻制备、保存技术最为成功， 自上个世纪五十年代已形成一套完整定型的工艺流程。
牛精液冷冻的冷源普遍应用液氮。颗粒精液在经液氮冷却的氟板(聚四氟乙烯)、铜纱网、铝板上滴冻。要使承接精液的表面与液氮面保持——定的距离(1～2厘米)。在滴冻的过程中，要维持在-80～-120℃的温度。滴冻前将经过平衡的精液充分混匀，并检查精子的活率。滴要迅速，颗粒要均匀，每毫升经过稀释的精液滴10粒左右为宜。滴冻结束后，要停留2～3分钟，待所有颗粒已冻结立即投入液氮。经抽样检查(一般随机抽取2粒) ，解冻活率在03以上者，即可装于纱布袋中，经标记后在液氮中保存。每滴冻完一头公牛的精液后，必须更换氟板等用具。 目前，细管的容量分025毫升和05毫升两种，由无毒塑料(聚氯乙烯)制成。管的一端填有棉塞和聚乙烯粉末，粉末遇水即固化自动封口，输精时又成为推送精液的活塞；另一端在注入精液后，可以聚乙烯粉或钢珠(或塑料珠)封口，要注意在封口处与精液间留有10～13毫米的空间，防止冷冻过程中因膨胀引起细管爆裂。
精液的贮存 牛的冷冻精液是以液氮做冷源进行贮存的，需要时可随时取出。为防止温度变化对精液品质的影响，取放动作要迅速，尽量减少在空气中停留的时间。从贮存容器中提取冷冻精液时，精液不应超过液氮容器的颈基部，避免因温度的回升造成精液解冻活率的下降。牛的冷冻精液已有40多年的历史。试验证明，保存至今的冷冻精液仍具有授精能力。但一般认为牛的冷冻精液随保存时间的延长，精子的活力和授精能力逐渐降低。牛冷冻精液长期保存的确切时限，尚需继续研究和观察。
2、家畜及多种动物的胚胎移植中，制备保存胚胎
目前多采用胚胎冷冻仪，属智能型冷冻仪。该仪器采用微机控制技术，专用软件，能较准确地控制液氮的施放量，从而保证被冻存的生物制品以适宜的冷冻速率降温冷冻。
3、液氮超低温保藏微生物技术
将菌种保藏在-196℃的液氮长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。大型真菌是菌物中的一个重要类群(菌物中形成大型子实体的一类真菌，泛指广义上的蘑菇或蕈菌)，很多种类具有较高的营养价值和药用价值，是目前菌物中最有开发应用前景的一类；此外，一些大型真菌能够分解枯死植物，对维持自然界物质循环、生态平衡有重要的作用，可开发应用于造纸业和环境净化；一些大型真菌能引起树木病害或损害多种木质产品，对此类病原真菌的认识的加强，有利于预防和减少危害的发生。大型真菌的规范性保藏对于微生物菌种资源的安全、高效保藏及、对长期有效保藏遗传资源、异地保藏生物多样性共享具有重意义
4、农业生物基因保存
上海投资4100多万元开始建设中国国内首家农业生物基因综合库。农业界人士说，最具全国市场开发潜力的种子产业，将以这个基因库作为育种材料的来源。总建筑面积超过3300平方米的上海农业生物基因库，设于上海农业科学院内，将保藏植物种子、植物离体材料、动物生殖细胞、微生物菌种和植物基因工程材料五大类农业生物遗传资源。
5、保存液氮疫苗
液氮苗是80年代中期逐渐推广应用的，先是使用Ⅲ型-FCl26炎鸡疱疹病毒液氮苗，后来国内外又研制出SBl，301／B、Z4，814等Ⅱ型液氮疫苗，并组合成II+III型二价苗及I+II+III三价苗，应用后都曾一度有效的控制了一些地区的鸡马立克氏病，II+III型二价苗好景不长，1993年马立克氏病又在北美和严态地区出现了较大规模的流行，为有效控制马立克氏病，一些国家开始学习荷兰自1927年使用I型CVl988／Rispens液氮苗后，有效控制马立克氏病的经验，美国、加拿大、巴西、日本、欧洲都先后从荷兰农业渔业部引进了CVl988／Rispens制苗种毒，在各自国家使用不同的工艺技术生产，保存于液氮罐中。
6、用液氮治疗奶牛乳头乳孔外口闭合、家畜皮肤瘤子等也较为普通。
二、 在医疗事业应用
1、低温医学
我国临床低温医学工作发展迅速，促进了移植医学的发展，特别是在骨髓、造血干细胞、皮肤、角膜、内分泌腺体、以及血管和瓣膜等的冷冻保存和移植应用取得了显著成绩。成功的造血干细胞移植依赖于造血干细胞活力的保存。生物样品在降温冷冻过程中，当由液态向固态变化的相变期内会释放一定热量，使其温度回升，不控制降温速率的冷冻过程将会导致组织细胞死亡。准确地测定生物样品的相变点，用微机编制降温程序，以便在样品相变时加大液氮输入量，克服相变样品温度的回升，使细胞安全而迅速地度过相变期，这是提高被冻样品成活率的关键环节。
2、临床医学
液氮是目前冷冻外科中应用最广泛的冷冻剂。是目前为止发现的一种最好的制冷剂，把它注入低温医疗器内，就像手术刀一样，可以做任何手术。冷冻是用低温来破坏病灶组织的一种治疗方法。细胞由于温度的急剧变化，组织内外水晶形成，使细胞脱水、皱缩，以致电解质等发生变化，冷冻还可使局部血流速度变慢，微血管血液瘀滞或栓塞造成细胞缺氧死亡。
据报导液氮冷冻治疗面部增生性及色素性疾病2138例，其中痊愈1 445例，治愈率6759％；显效329例，有效207例＼总有效率为8297％。雀斑及脂溢性角化病的治愈率分别为7923％和8469％；色痣(包括黑子)5225％及睑黄瘤4167％。扁平疣患者冷冻后有新皮疹在皮损处发出，故对于进行期扁平疣不宜采用冷冻治疗，静止期冷冻效果好。2例有黄褐斑的患者色痣治疗后有色素沉着，该2例经有效的治疗后色素恢复正常，提示对有黄褐斑者亦不宜采用冷冻治疗。对色痣的治疗，要根据部位及患者的要求采取相应的治疗方法，黑子及较小的色痣(直径<3mm )可采取液氮冷冻的方法治疗，较大的色痣应以手术切除并行病理检查为佳。
采用液氮冰冻配合中药治疗尖锐湿疣，无毒副作用，痛苦小，治愈率高，复发率低，术后不留疤痕，并发症少，治疗时间短，经济，是治疗尖锐湿疣的理想方法之一
液氮冷冻疗法治疗结节性痒诊、粘液囊肿、多发性寻常疣及神经性皮炎采用的液氮直接喷射法治疗慢性咽炎，将液氮直接喷射在病变表面，降温快、深、面广，并能消灭中间地带，收到满意的近期效果。每个冻融周期掌握在1min左右，连续4～5个冻融周期。每周仅1次。
三、在食品工业应用
1、液氮在食品速冻中的应用
在众多的保藏法中，冷冻保藏法应用最为广泛，效果也非常显著。而作为冷冻保藏方法之一的液氮速冻早已被食品加工企业所采用，由于它能实现低温深冷的超速冻，也有利于实现冻结食品的部分玻璃化，使食品解冻后能最大限度地恢复到原来的新鲜状态和原有的营养成分，极大提高了冷冻食品的品质，因此在速冻工业中显示出特有的生命力。与其它冷冻方法相比，液氮速冻具有以下明显的优点：
① 冷冻速度快(冻结速度比一般冻结方法约快30-40倍)：采用液氮速冻，可使食品迅速通过0℃～5℃最大冰晶生长带，食品研究人员已在这方面做了有益的尝试。
②保持食品品质：由于液氮速冻时间短，经液氮速冻的食品可以最大限度地保持加工前的色、香、味及营养价值。段振华等人用液氮对槟榔进行速冻处理，结果表明经液氮处理后的槟榔保持有较高叶绿素含量，风味好。
③物料干耗小：一般冻结的干耗损失率为3～6％，而液氮速冻可减少到025～05％。
④设备与动力费用低，易于实现机械化和自动化流水线，提高生产率。
目前液氮速冻主要有喷淋冻结、浸渍冻结和冷空气冻结三种方式，其中又以喷淋冻结应用最为广泛。
2、液氮在饮料加工中的应用
目前，已有不少饮料生产厂家采用氮或氮与C02的混合物取代传统的C02，对饮料进行充气包装。充了氮的高碳酸型饮料，比仅充填二氧化碳的饮料引起的问题要少；氮对于灌装无泡饮料，如酒和果汁也是很理想的。在非充气饮料罐头中加注液氮的好处是，所注入的少量液氮可排除每只罐头顶部空间中的氧气，使贮罐上部空间的气体呈惰性，从而延长了易腐品的贮存期限。
3、液氮在果蔬贮存保鲜中的应用
液氮用于果蔬的贮存保鲜具有气调的优点，可调节农副产品旺季和淡季供需方面的矛盾，减少贮存上的损失。气调的功能是提高氮气的浓度，同时控制氮、氧与C02的气体比例，并使其保持在稳定状态，降低果蔬的呼吸强度，延缓后熟过程，从而使果品、蔬菜保持采摘时的新鲜状态和原有营养价值，延长果蔬保鲜期。
4、液氮在肉制品加工中的应用
液氮在对原料肉绞制、斩拌或混合等工序中加入，可有效提高产品质量。如在沙拉米型香肠加工中，液氮的使用可提高肉保水性，阻止脂肪氧化，改善切片性和外观质量；用于肉制点心、肉脯等再制肉的加工，不仅可使肉糜混合时加速蛋白质溶解和增强保水性，且对保持产品特有形状尤为有效。另外原料肉经液氮快速冷却，既可在较长时间内保持热肉特性，气又保证了肉品卫生安全；在加工工艺上，无须再担心温度上升对肉质的影响，且加工可不受原料温度、加工时间、季节因素的影响，同时还可使加工过程处于低氧分压，在一定范围延长了产品的货架寿命。
5、液氮在食品低温粉碎中的应用
低温粉碎，就是将冷却到脆化点温度的物质，在外力作用下破碎成粉体的过程。食品的低温粉碎是近几年发展起来的一种食品加工新技术，该技术特别适宜于加工含芳香成分多、含脂量高、含糖量多和含胶状物质多的食品。用液氮进行低温粉碎处理，可连原料的骨、皮、肉、壳等一次性全部粉碎，使成品颗料细小并保持其有效营养。如日本将经液氮冻结后的海藻、甲壳素、蔬菜、调味品等，投入粉碎机粉碎，可使成品微细粒度高达100μm以下，且基本保持原有营养价值。此外，用液氮进行低温粉碎，还可粉碎常温下难以粉碎的物料、热敏性及受热易变质，易分解的物质。另外，液氮可以粉碎如脂肪多的肉类、水分多的蔬菜等在常温下难以粉碎的食品原料，并可以制造迄今未曾有过的新加工食品。
6、液氮在食品包装中的应用
英国伦敦一家公司开发出一种简单实用的食品保鲜包装方法，就是在给食品进行包装时，往包装袋内加入几滴液氮。当液氮蒸发转化成气体时它的体积迅速扩大，在包装袋内快速取代原有的大部分气体，减少食品因氧化而造成的变质，从而大大延长食品的保鲜期。
7、液氮在食品冷藏运输中的应用
冷藏运输是食品工业中很重要的一部分。开发液氮制冷技术，发展液氮冷藏火车、冷藏汽车及冷藏集装箱是现今国际上的共同发展趋势。经济发达国家多年的应用实践表明，液氮制冷系统是唯一在商业上可与机械制冷系统相竞争的冷藏保鲜技术，也是食品冷藏运输的发展方向。
8、液氮在食品工业中的其它应用
由于液氮的制冷作用，蛋汁、液体调味品、酱油能够加工成可自由流动并能倒出的颗粒状冷冻食品，这些食品可随时使用并且很容易配制。在研磨香料和吸水的食物添加剂，如糖的替代品和卵磷脂时，液氮被注入到研磨机中来保护有价值的成分，同时也增加了研磨产量。周顺华等人研究证明，利用液氮淬冷协同高温解冻进行花粉破壁具有效果好、破壁率高、速度快及花粉生理活性保持稳定、不受污染等特点。
四、在电子工业中应用
1、超导技术
超导体得天独厚的特性，使它可能在各种领域得到广泛的应用。以液态氮代替液态氦作超导制冷剂获得超导体，使超导技术走向大规模开发应用，认为是2 0世纪科学上最伟大的发现之一。
超导磁悬浮技术的基础是由钇钡铜氧(YBCO)构成的超导陶瓷，当这种超导材料被冷却到液氮温度(78K，相当于-196~C)时，就从正常态转变为超导态。由屏蔽电流产生的磁场与轨道磁场相互排斥，如果排斥力大于列车的重量，车体就可以悬浮在空中。同时，在冷却过程中，由于超导体的磁通钉扎效应，一部分磁场被俘获在超导体内。这一俘获磁场与轨道磁场相互吸引，由于斥力和吸引力的同时存在，车体得以稳定地悬浮在轨道上方。与常规磁铁之间同性相斥，异性相吸的作用不同，超导体和外磁场之间的这种既排斥又相吸的相互作用，使超导体或永久磁铁都可以克服自身重力，悬浮或倒挂在对方的下面。
2、电子元件制造与检测
环境应力筛选就是选择若干典型环境因素，将适量的环境应力作用于组件或整机，把元器件工艺缺陷，即生产和装配过程中的缺陷激发出来，给予修正或更换。环境应力筛选采用温度循环和随机振动较为有效。温度循环试验是采用高的变温率、大的热应力，使那些不同材料组成的元器件，因结合不良、材料本身的不均匀性、工艺中缺陷等所造成的隐患而迅速失效，采用变温率为5℃／分；极限温度为-40℃，+60℃；循环次数为8次。这样的环境参数组合使得虚焊、夹伤部位、元器件本身缺陷的暴露较明显。对于大批量的温度循环试验，可以考虑采用二箱法。在这种情况下，应当在级进行筛选。
液氮是一种更快和更有效的屏蔽和测试电子元器、电路板的方法。
3、低温球磨技术
低温行星式球磨机是将液氮气体源源不断地输入装有保温罩的行星式球磨机中，这些冷气将高速旋转的球磨罐产生的热量及时吸收，使装有物料、磨球的球磨罐始终处于一定的低温环境中．在低温环境中混合、细磨、新产品研制和小批量生产高新技术材料的必备装置。该产品体积小、功能全、效率高、噪声低，广泛应用于医药、化工、环保、轻工、建材、冶金、陶瓷、矿产等部门。 ．
4、绿色切削加工技术
低温切削是利用低温流体如液态氮、液态二氧化碳和冷风等喷向加 工系统的切削区域，造成切削区的局部低温或超低温状态，利用工件在低 温条件下产生的低温脆性，提高工件的切削加工性、刀具寿命和工件表面 质量。根据冷却介质的不同，低温切削可分为冷风切削和液氮冷却切削。 低温冷风切削法是通过向刀尖的加工部位喷-20℃～-30℃ (甚至更低)的低温气流，并混入微量的植物性润滑剂(每小时10~20m 1)，从而起到降温、排屑、润滑的作用。低温冷风切削与传统切削相比，能够提高加工 效率，改善工件表面质量，而且对环境几乎无污染。日本安田工业公司的 加工中心采用在电机轴、刀杆轴的中心插入绝热风管的结构，使用-30℃ 的低温冷风直接通向刀刃。该结构大大改善了切削条件，有利于低温冷风 切削加工工艺的实施。横川和彦对车削和铣削中的冷风冷却进行了研究。在铣削试验中，分别采用水基切削液、常温风（+10℃）和冷风(-30℃ )三种条件进行比较，结果表明，采用冷风切削时刀具耐用度显著提高。在车削试验中，冷风(-20℃ )切削时刀具磨损率比常温风(+20℃ )切削时显著下降。
液氮冷却切削主要有两种应用形式，一种是利用瓶装压力将液氮像切削液一样直接喷射到切削区；另一种是利用液氮受热蒸发循环来间接冷却 刀具或工件。目前低温切削加工主要应用于钛合金、高锰钢、淬硬钢等难 加工材料的加工中。KPRaijurkar采用H13A硬质合金刀具、并用液氮循环冷却刀具的方法对钛合金进行了低温切削加工试验，试验结果表明，与传统的切削方法相比，刀具磨损明显减少，切削温度降低30％，工件表面加工质量得到很大改善。万光民采用间接冷却方法对高锰钢进行了低温切 削加工试验，结果表明，采用间接冷却方法低温加工高锰钢时，刀具所受冲击力减少，刀具磨损减小，加工硬化现象得到改善，工件表面质量也有所提高。王连鹏等人采用液氮喷淋的方法在数控机床上低温切削加工45淬硬钢，试验结果表明，采用液氮喷淋式低温加工45淬硬钢可以提高刀具耐用度，改善工件表面质量。
在液氮冷却加工状态下，硬质合金材料能保持其抗弯强度、断裂韧性和耐冲击强度，其硬度随温度的降低而增大，因此硬质合金刀具材料在液氮冷却中能够保持其优良的切削性能，并且和在常温下一样，其性能决定于粘结相的数量。对于高速钢，随温度的降低，其硬度增大而抗冲击强度降低，但总体上能保持较好的切削性能。他对一些材料在低温下提高其切削加工性进行了研究，选用了低碳钢AISll010、高碳钢AISl070、轴承钢 AISIE52100、钛合金Ti-6A 1-4V、铸造铝合金A390五种材料，实验研究表明：由于低碳钢表现出良好的低温脆性，低温切削可获得理想的加工效果；对于高碳钢和轴承钢，应用液氮冷却可抑制切削区温升和刀具磨损速度；在切削铸造铝合金时，应用低温冷却可提高刀具硬度和刀具抗硅相磨粒磨损能力，在加工钛合金时，同时低温冷却刀具和工件，可有效地降低切削温度和减少钛和刀具材料之间的化学亲和力。
五、其它领域
酒泉卫星发射中心特燃站生产液氮，它是火箭燃料的推送剂，大量的液氮用高压把火箭燃料推向燃烧室。
应用于高温超导电力电缆开发；应用于紧急维修中对液体管道进行冻结；应用于物质的低温稳定和低温淬火；液氮冷装配技术(热胀冷缩现象在工业中的应用)也广泛使用；液氮人工增雨技术；液氮排液技术及时降液诱喷，正在不断深入研究。
采用氮气井下灭火，火势被迅速扑灭，同时又消除了瓦斯爆炸危险等。
为什么选择液氮：因为比其它方法冷却得更快，并且不与其它物质起化学反应，大大地节省空间，提供了干燥的气氛，它是环保的（液氮使用后直接挥发成气体返回大气中，不会留下任何污染），它用起来简单方便。
不同的ES配方多少有些差异基础培养基一般用DMEM或DF12（以下为DMEM培养基为例）
1、提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻;
2、在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分(如，丙酮酸钠、抗生素等)，按照比例加入dmem培养基中，作好标签;放入4℃冰箱保存。
ES细胞培养方法：
化冻
将血清(Fetal Bovine Serum，Hyclone)从-20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜;也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存;
灭活
(1) 放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准);
(2) 当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟;若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短(比如：不超过5分钟)，则仍可使用;若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME
胞的培养;
(2) 取出，自然冷却至室温(约需1-3小时)，可分装或-20℃继续冻存;
分装
(1)转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀;吹出血清时要注意：不要吹出气泡(血清很粘稠，很容易产生气泡;如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下);标好批号和日期;
(2)放入-20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。
原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备
1取125-135dpc孕鼠，断颈处死;
2将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫)，剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中;
3 把平皿转入超净台;
4 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);
5 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次;
6 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);
7 加入适量Trypsin-EDTA(025% Gibco 25520，下同)，体积约等于组织块体积;
8 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘)，加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀(5-10次)，静置;
9 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。
10 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);
11 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签(ME-0;注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好)，转入培养箱培养;
12 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次)，若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代(视细胞疏密而定)，放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。
饲养层细胞(Feeder)的制备
注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem)
弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);
放入培养箱培养3小时(2-4小时);
用01% 明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可)，室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止;
弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性);
加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞)，半小时后即可使用(如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上)，可使用6-10天，用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做)。
ES细胞的复苏
提前制备好相应数量的Feeder;
准备37-39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管(冻存细胞)，迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化;
转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟;
弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中(冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿)，补加适量培养液;
转入培养箱培养，次日换液;此后每24小时换一次液，每48小时传一次代(视生长情况)。
ES细胞的换液
1 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内)；
2细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察(判断生长情况，并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;
3 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基(6 cm培养皿约5 mL，35 cm培养皿约3 mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基);
4 放回培养箱继续培养。
ES细胞的传代
前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;
提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内);
将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少;
将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去;再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打(视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来)，滴加补加培养基至5 ml左右(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为35cm培养皿，则补加至3ml左右)，作好标签;
前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。
ES细胞的冻存
常规方法将细胞消化成单细胞悬液;
转入试管，1000转/分钟离心5分钟;
配适量冻存液(为含10% 二甲亚砜(DMSO)，10% FBS的DMEM培养液);
弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液(只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可)，转入冻存管，作好标签;
放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。
欢迎分享，转载请注明来源：品搜搜测评网
微信扫一扫
支付宝扫一扫
