红凤菜的药用价值

营养成分 百克干物质中含：钙1443g；磷017-03g；钾283-463g；镁092-106g；铜397ppm；铁129-209ppm；锌26-75ppm；锰47-148ppm；维生素C和粗蛋白含量也较高。

化学成分含花色苷（anthocyanin）

药性味辛、甘、性凉。清热凉血，活血、止血、解毒消肿。

药用主治咳血、崩漏、外伤出血、痛经、痢疾、疮疡毒、跌打损伤、溃疡久不收敛。根茎止渴、解暑。叶健胃镇咳。

用法用量 内服：煎汤，10～30g，鲜品30～90g。

外用；适量，鲜品捣敷；或研末撒。

毒性欧洲食品安全局（EFSA）关于吡咯里西啶生物碱 （PAs） 暴露报告摘录：PAs广泛分布于植物界，特别是紫草科、菊科、豆科植物中。截至目前，已被知晓的该种生物碱约有600种。很多PAs具有明显的肝脏毒性，因此称为肝毒吡咯里西啶生物碱。有报告的人类急性/短期毒性已知最低剂量是3mg PA/kg bw per day，男孩，暴露时间4天，致命；08-17mg PA/kg bw per day，女孩，2周曝露时间，草药致静脉闭塞性疾病（HVOD）；有报告与人类长期毒性相关的已知最低剂量是15 µg PA/kg bw perday，为期6个月的曝露。

肾脏是人体的重要器官，结构复杂，担负多种功能，肾穿刺活体组织检查病理诊断是当今肾脏病学的一个重要组成成分，是病理学的一个重要分支，是肾脏疾病诊断的必不可少的手段。肾穿刺活检的开展，可帮助临床医师制定治疗计划;对移植肾可以确定排斥反应的有无、类型和严重程度，并对移植肾的急性肾小管坏死、环孢素中毒、复发和再发性肾小球肾炎作出明确的病理诊断。 肾活检标本通常由经皮肾穿刺，开放性肾穿刺活检或肾切除获得，肾活检标本应分为三份，供LM、IF、和EM 检查。从活检标本的两端各取1 mm 的小块做EM 检查，从皮质端切取2 mm 的小块做IF 检查，剩下的做LM 的常规石蜡包埋。做LM 的组织应在有缓冲液的10 %的甲醛固定液固定，固定后可用石蜡或塑料包埋，制成超薄切片，厚度要求2μm～3 μm 常规进行苏木素2伊红（HE) 染色，过碘酸2雪夫（PAS) 染色，六安银（PASM) 染色和Masson 三色染色。

做IF 检查的组织应进行冷冻处理，首先将组织块置入冰冻切片用的OCT 包埋液，再置入冰冻切片机冷室中。EM 检查的标本，最好用锋利的刮胡刀片（用酒精或二甲苯将油洗净） 将组织切成1 mm 立方的小块，然后尽快放入冷戊二醛或carson 甲醛固定液。

一般做LM 要求10 个以上肾小球，IF 要求5 个以上肾小球，EM 要求1 个肾小球即可。 根据病变的主要部位，肾脏疾病基本分为肾小球疾病、肾小管疾病、肾间质疾病和肾血管疾病。根据病因发病机制，肾脏疾病基本分为变态反应性炎症，病原微生物直接引起的炎症，代谢性疾病，先天发育异常，遗传性疾病，肿瘤等。所以光微镜,免疫病理学检查和电子显微镜检查等病理学方法常是不可缺少的。肾脏疾病的诊断常是应用上述的病理学方法，全面观察和分析肾脏各部位的病变，在结合临床表现，综合判断的结果，现将肾脏疾病观察要点总结如下。

⒉ 1 肾小球检查

⒉ 1 1 光镜　毛细血管袢的体积和分布（分叶状，管腔扩张） 、细胞增生状态、病变分布（弥漫，局灶，球性，节段性） 、系膜宽度及成分、白细胞浸润、纤维索样坏死及分布、GBM 和血管壁、微血栓、沉积物或嗜复红蛋白（部位及类型） 、新月体（类型及百分比） 、硬化（分布及百分比）。

⒉ 1 2 免疫病理　阳性或阴性反应、免疫球蛋白、补体及纤维素的种类、部位、图像（线状、颗粒状及团块状） 、强度。

⒉ 1 3 电镜　GBM（厚度、密度和轮廓等） 、各种细胞的形态和病变、细膜区的特点、电子致密物（类型和部位） 、特殊结构和特殊物质。

⒉ 2 肾小管检查

⒉ 2 1 光镜　坏死、再生、管腔扩张、管型（类型） 、结晶、细胞内包含物、细胞变性、基底膜。

⒉ 2 2 免疫病理　免疫反应（类型部位和强度）。

⒉ 2 3 电镜　细胞形态和病变、包含物、基底膜、电子致密物（类型，部位）。

⒉ 3 肾间质检查

⒉ 3 1 光镜　水肿、炎症细胞浸润（种类和面积） 、纤维化。

⒉ 3 2 免疫病理　免疫反应（类型部位和强度）。

⒉ 3 3 电镜　细胞浸润（种类部位） 、电子致密物（类型部位）。

⒉ 4 肾血管检查

⒉ 4 1 光镜　内膜病变、弹性膜病变、中层病变、玻璃样变性、血栓、炎症性病变、肾小球旁器病变。

⒉ 4 2 免疫病理　免疫反应（类型部位和强度）。

⒉ 4 3 电镜　内膜病变、弹性膜病变、中层病变、电子致密物（类型部位）。 ⒊ 1 不同的肾脏病理形态表现可导致相同的临床综合征肾病综合征和血尿可由以下疾病引起：遗传性肾病、膜性增生性GN、IgA 肾病、急性增生性GN 等；肾病综合征可由以下疾病引起：微小病变、局灶节段性肾小球硬化症、膜性肾病、糖尿病性肾病或淀粉样变肾病等。

⒊ 2 一种临床综合征可以产生不同的肾病变类型　如：狼疮性肾炎，不同类型预后不同。

⒊ 3 同一病理类型或病变过程可以出现许多不同疾病。

⒊ 4 仅有少许肾活检　如：Alport 遗传性肾病等，凭单一的病理学方法（EM 检查） 做病理诊断，而多数肾病理诊断是一个综合过程，必须分析和对照所有的临床资料以及LM、EM和IF 的检查结果，才能得出正确的病理诊断。

　　皮：上皮组织紧密排列的细胞和少量细胞间质组成。胶原纤维和弹性纤维。

　　指甲：角蛋白。

　　成人表皮主要由三种细胞构成，除角质形成细胞外，还包括黑素细胞(melanocyte)和郎格汉斯细胞(Langerhans’cell)。此外，在某些部位还存在默克尔细胞(Merkcl Cell)．

　　角质形成细胞(keratinocyte)

　　是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白(keratin)。目前已鉴定出多种角蛋白基因，主要包括酸性和碱性两大类角蛋白基因。根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。基底细胞层(basal cell layer)又称生发层，为一层柱状上皮，位于表皮最下层，正常情况下大约有30％的基底细胞进入分裂象。主要产生新的表皮细胞。棘细胞层(pricklC ccu layer)一般由4—8层多角形带棘突的细胞组成。下部的棘细胞也有分裂功能，可参与创伤愈合。上部的棘细胞渐趋扁平，与颗粒层细胞相连。棘细胞胞浆内的张力微丝较基底细胞的为多，是向角化发展的过程。颗粒层（stratumgranulosum）一般为2—4层梭形细胞，是进一步向角质层分化的细胞。角质层增厚时颗粒层也相应地增厚。这些细胞中有较多大小不等、形状不规则、嗜碱性的透明角质颗粒(keratohyaline granules)。细胞核和细胞器在颗粒层中溶解。透明层（stratum lucid—um)仅旦于手掌和足跖表皮，是角质层的前期。为2—3层扁平、境界不清、无核、紧密相连的细胞。角质层(stratum corneum)是由4—8层已经死亡的扁平无核细胞所组成的保护层。 其细胞器已经溶解，水分丢失，细胞膜变厚，细胞中充满了由透明角质颗粒分解而产生的含硫的基质与张力微丝招融合而成的软纤维性蛋白，即角蛋白。

　　表皮细胞通过时间和表皮更替时间

　　角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。在单一移行过程中，角质形成；阻胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层，约需14天；再通过角质层而脱落下来又霈14天，共28天，称表皮细胞通过时间(transit time)，如果加上基底细胞的分裂周期13-19天，共约41一47天，称为表皮更替时间(turn ovel．timc)。了解角质形成细胞的细胞动力学特性对理解某些皮肤疾病的发病机制十分重要。在银屑病患者，基底细胞分裂周期缩短为37．5小时，表皮更替时间也缩短到8~10天细胞不被部分这个并发出成熟，因此形成角化不全，临床表现为大量鳞屑。

　　桥粒(dcsmosomes)

　　角质形成细胞之间借助桥粒互相连接，光镜下的桥粒呈棘刺状，电镜下可见中央层(cerltralstratum)和附着斑(attachment plaquc)，其上有张力微丝(tonofilament附着。桥粒主要由桥粒(desmosomallcorc)和桥粒斑(desmosomalplaqtlc)两类蛋白组成。新生的角质形成细胞自基底层向上移行，故有人认为桥粒可以分开并重新形成。张力微丝是角蛋白的前身，它对保持细胞的形态起重要作用，也是形成角蛋白的重要成分。桥粒的作用是维持细胞间的连接，一旦桥粒受到破坏，则会引起角质形成细胞的松解而出现表皮内疱，如天疱疹。

　　表皮下基底膜带

　　表皮与真皮之间的连接由向真皮伸入的表皮脚(epidermal ridges or pegs）和向表皮伸人的真皮乳头(dermal papilkae）浪状互相镶嵌而成。用PAS染色，在表皮与真空交界处可见含有糖蛋白的红染带，称为表皮下基底膜带(subeoithelial basement membranezone)。电镜下该带分为四层：①基底细胞膜，包括半桥粒(hemidesmosome、附着斑和基底层下致密板)；②透明板(lamina lucida)为厚约30—40mm的电子透明带；含大疱性类天疱疮抗原；③基底板(basal lamina)，又称致密板(1arrdm densa)，为35—45nm厚的电子致密带，系光镜下的基底膜，主要由Ⅳ型胶原组成；④致密板下带，主要由胶原纤(collagenfibril) 和锚状纤维（Anchoring fibril)组成，后者的主要成分是Ⅶ型胶原。了解表皮下基底膜带的结构将有助于理解气天性和后天性大疱性皮肤病的发病机制。基底细胞底部的细胞膜上只有半个桥粒状结构，称之为半桥粒(henli-desmosome)。许多纤细的纤维将半桥粒与其下的真皮胶原纤维结合起来，故正常表皮与真皮间的连接是比较角化过程 角蛋白是角质形成细胞分化后的最终产物，其功能主要是抵抗机械性、理化因素和微生物的侵袭。对机体起到防护作用。角蛋白是一个大家族，其中有30余种，按照其基因可以分为两大类，碱性的工型和酸性的Ⅱ型角蛋白。角蛋白一般成对存在，分别包含工型和Ⅱ型各一种角蛋白。在基底细胞和棘细胞中主要是角蛋白K5和K14，随着细胞向上逐渐分化，到颗粒层和角质层则被角蛋白Kl和Kl。替代。在银屑病等表皮增生过度性疾病中则可见到角蛋白K6和K16。单纯性大疱表皮松解症和大疱性红皮病性鱼鳞病均与角蛋白基因突变有关。

　　黑素细胞

　　位于基底层中，约占基底层细胞的1%。其主要作用是产生黑素(mclanin)。黑素细胞借助其较多的树枝突起，向邻近的一些基底细胞和棘细胞输送黑素颗粒。每个黑素细胞借助树枝状突起可与大约36个角质形成细胞接触，形成表皮黑素单位。用银染色及DOPA反应可示其胞浆及树枝状突起中有黑素小体(melanosome)。其中富含酪氨酸酶，黑素即在此小体中合成。角质形成细胞吞噬经黑素细胞树突输送来的黑素颗粒，后者在基底层细胞核上方较多，起到反射光线的作用。肤色的差异主要与黑素细胞产生黑素的数量有关而与黑素细胞的数目无关。黑素细胞在暴露部位如面部及乳晕、腋窝、生殖器、会阴部等处较多。

　　郎格汉斯细胞（Langerhans’cell)

　　为一种树枝状细胞，主要分布于棘细胞间，占表皮细胞的3％一5％。氯化金染色可见树枝状突起，s00、CDl及Atp酶染色阳性，DOPA染色阴性，无桥粒。电子显微镜下可见其胞浆中有呈网球拍状的颗粒(Birbeck granule)。其麦面具有C3b和IgG、IgE的Fc受体，携带HLA-DR、-DP和-DQ抗原。现已证实它起源于骨髓而进入表皮，属于单核一吞噬细胞系统，它与移植排斥、原发接触致敏和免疫监视等许多免疫反应密切相关，是一种重要的。有吞噬作用并能加工及递呈抗原的免疫活性细胞。

　　默克尔细胞（Merkel’s cell）

　　接近基底层，不分枝，与角质形成细胞之间有桥粒相连。脑浆中有一些椭圆形颗粒，颗粒中含有神经介质。这种细胞多见于掌跖、指趾、口唇及生殖器、毛囊等部位，推测其功能与皮肤的精细触觉有关。

1) 并非强调，是一种句型：si c'était laura et Frederic, ca ne m'etonnerait pas

那个que　可由可无，一般说；ca serait laura et Frederic ca ne m'etonnerait pas

2）：像这种句子，你把c＇est．．．　que　．．．　去掉　：（C'est ）du cote de la mariee （qu）'ils ne savent pas　：这个强调的是状语，连顺序都不用倒，你就明白了　qui　ne　sait　pas　？　ils　ne　savent　pas　，＂ils＂，　c＇est　qui　？　les　gens　du　côté de la mariée :是新娘家的人不知道　－－ils　　那些人，他们－－或者说，　险酿家，他们不知道

savoir后面不是接直宾吗　：可是你的句子中，que　后面什么也没有，所以根本没有直接宾语

给你强调一下直宾：

C'est la date du mariage qu'ils ne savent pas , du côté de la mariée

C'est le nombre des invités qu'ils ne savent pas , du côté de la mariée

这是考查的绝对否定的知识：

1在以ce n'est pas,ce ne sont pas构成的否定句中，不能用pas 代替不定冠词或部分冠词

ex:Ce sont des etudiants----------Ce ne sont pas des etudiants

2如果否定不是针对全句，而是针对句子的某个成分，不能用pas 代替不定冠词或部分冠词

exJe n'ai pas le temps de sortir avec vous

3如果名词是用定冠词表示总体概念或确指的人或事物时，句子即使是否定的，也不能用pas 代替不定冠词或部分冠词

exJ'aime le fromage------je n'aime pas le fromage（总体概念）

4当un意为‘seul’时，同样不能用de代替un

exIl n'y a pas eu un survivant

医学科研实验基础知识笔记（四）：细胞自噬研究策略

细胞自噬是指细胞在外界环境因素的影响下， 细胞利用溶酶体降解自身受损、 变性或衰老的大分子物质以及细胞器的自我消化过程。自噬是细胞的一种自我保护机制， 广泛存在于真核细胞内， 在调节细胞生存和死亡的过程中， 起着重要的作用。

当细胞发生自噬后， 在自噬相关基因的调节下， 细胞通过单层或双层膜， 包裹待降解的细胞质或细胞器， 形成囊泡状的自噬体（autophagosome） 。然后自噬体再和溶酶体（lysosome）

发生融合形成自噬溶酶体（autolysosome） ， 由溶酶体内的一系列水解酶， 降解自噬溶酶体内所包裹的内容物， 以实现细胞对自身代谢和能量的更新。

1自噬的细胞学分类及过程

根据细胞内物质运输到溶酶体的方式以及生理功能的差异， 哺乳动物的细胞自噬可以分为三种类型：大自噬/宏自噬（macroautophagy） ， 小自噬/微自噬（microautophagy） 和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） 。

1） 大自噬/宏自噬：我们通常所说的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的过程中， 细胞质中可溶性的大分子物质以及变性的细胞器， 被内质网、 线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体。接着自噬体的外膜与溶酶体膜融合， 进一步形成自噬溶酶体， 自噬体内的待降解物被一系列的水解酶降解， 最终完成整个的自噬过程。

2） 小自噬/微自噬：与大自噬过程不同， 是溶酶体膜自身发生内陷， 包裹和吞噬细胞内待降解的底物， 并在溶酶体内发生降解。小自噬与大自噬的区别就在于， 在小自噬过程中胞质成份是直接被溶酶体包裹， 没有形成自噬体的过程。

3） 分子伴侣介导的自噬：在分子伴侣介导发生的自噬过程中， 其待降解的底物都是可溶性的蛋白质分子。分子伴侣蛋白识别带有特定氨基酸序列的底物蛋白质分子， 并与之结合， 然后再经溶酶体膜上的受体 Lamp2a（lysosome-associated membrane protein 2， Lamp2） 转运到溶酶体；底物蛋白分子再在溶酶体内， 被水解酶降解。因此， 分子伴侣介导的自噬与前两者不同， 在降解蛋白时具有选择性。而大自噬和小自噬现象中， 一般而言， 在降解蛋白时没有明显的选择性。

2自噬信号通路

3自噬与凋亡的关系

细胞凋亡也被称为 I 型程序性细胞死亡；自噬则被称为 II 型程序性细胞死亡。凋亡和自噬是两种显著不同的细胞死亡形式， 两者在形态、 生化指标以及调控细胞死亡的过程上都存在着较大的差异， 但两者又不是两个完全独立的过程。许多研究表明， 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情况下也是相互影响和制约的。自噬和凋亡之间存在着三种不同类型的相互作用，而且每种类型都对应着相应的特定的细胞类型、 刺激和环境。

1） 自噬和凋亡互相协同， 共同促进细胞死亡。两种效应之间， 可以其中一种效应影响另一种效应；自噬也可以作为凋亡的上游调节因子， 直接调控细胞凋亡， 从而影响细胞的死亡；

2） 自噬可以通过促进细胞存活而拮抗细胞的凋亡效应。比如， 可以通过去除因氧化应激受损的细胞器， 或降解变性的大分子物质， 为饥饿的细胞提供生存所需要的营养和能量；或者通过降解未折叠的蛋白来抑制内质网应激。自噬的这些功能将会抑制促凋亡信号的产生， 从而起到拮抗细胞凋亡的作用。

3） 自噬有时虽然自身并没有导致细胞死亡， 但却参与了细胞凋亡的过程。比如自噬参与了一些 ATP 依赖的凋亡过程。

4自噬的分子机制和特征

1） 自噬诱导阶段（induction） ：正常生理状态下， 细胞保持很低的基础自噬水平。这时细胞内能量充足，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1(也就是 mTOR 复合物 1，也叫做 mTORC1)处于活化的状态。活化的 mTORC1 通过磷酸化的方式使得 ATG13 发生磷酸化反应， 从而抑制细胞的自噬。

2） 成核过程（vesicle nucleation） ：成核过程和 Vps34-ATG6 复合物密切相关。这个复合物还包含有调节性蛋白激酶 Vps15， 共同作用于膜泡的成核， 介导 PAS(也就是前自噬体结构pre-autophagosomal structure)的形成。

Vps34-ATG6 复合体还可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3， 并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。请大家注意， Vps34 在哺乳动物中的同源蛋白是 class III PI3K；ATG6在哺乳动物中的同源蛋白是 Beclin-1， 所以 Vps34-ATG6 复合体， 也被称为 PI3K-Beclin-1复合物。

3） 自噬体的延伸阶段：这个过程的分子机制是最为复杂的。哺乳动物自噬体的延伸主要依赖于两个类泛素化的系统：a） ATG12 的结合过程；b） LC3 的修饰过程。

ATG12 的结合过程是类似泛素化的过程， 需泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。ATG12 首先由 E1样酶 ATG7 活化， 再通过 E2 样酶 ATG10 转运并结合 ATG5， 然后和 ATG16 结合， 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多体复合物。这个复合物定位于前自噬体结构的外膜表面， 并参与前自噬体外膜的扩张。

LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修饰过程同样需要类似泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。LC3 前体形成后被 ATG4 加工成胞浆可溶性的 LC3-Ⅰ， 然后在 E1 样酶 ATG7 和 E2样酶 ATG3 的作用下， 和磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接成为脂溶性的 LC3-PE（也就是 LC3-II），并参与膜的延伸。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合， 直到自噬溶酶体(Autolysosome)的形成。因此， LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物， 也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。

哺乳动物的 ATG12-ATG5 类泛素化过程和 LC3 类泛素化过程并不是独立运行的， 它们之间可以相互作用、 相互调节。

4） 自噬体的成熟阶段：自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(Rab S)作用下， 与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程。参与成熟阶段的溶酶体相关蛋白还包括：LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)。

5） 自噬体的裂解阶段：是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、 能量或循环利用。

5自噬诱导剂

a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

e) Rapamycin：mTOR抑制剂

f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

6自噬抑制剂

a) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂

b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

c) Hydroxychloroquine（羟氯喹）

除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

7自噬的检测手段

自噬的评估通常采用多个自噬阶段的标志物，因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段降解被抑制所致，所以设置合适的对照很有必要。

（1）透射电镜，电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构；

（2）WB检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1；生化检测自噬体膜标志蛋白， 特别是ATG12、 ATG5 和 LC3；荧光显微镜检测 LC3 或GFP-LC3 斑点的形成；生化检测自噬底物 p62。

（3）WB检测Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。

（4）组织蛋白酶Cathepsin活力检测。

（5）IF检测自噬潮autophagic flux

自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

（1）观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

（2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

（3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。需要多种检测方法结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）

（4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异

（5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

（6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。

由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔

（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用01%SDS处理。）

8自噬研究常规思路

通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：

（1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）

（2）证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）找到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）

（3）在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。

9研究自噬的文献参考

[1] Emerging Mechanisms in Initiating and Terminating Autophagy Trends Biochem Sci 2017 Jan;42(1):28-41

[2] Targeting autophagy in cancer Nat Rev Cancer 2017 Sep;17(9):528-542

[3] Autophagy: controlling cell fate in rheumatic diseases Nat Rev Rheumatol 2016 Sep;12(9):517-31

[4] Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis Nat Rev Immunol 2016 Nov;16(11):661-675

[5] Autophagy and Neurodegeneration: Pathogenic Mechanisms and Therapeutic Opportunities Neuron 2017 Mar 8;93(5):1015-1034

[6] Activating autophagy to potentiate immunogenic chemotherapy and radiation therapy Nat Rev Clin Oncol 2017 Apr;14(4):247-258

[7] Epigenetic Control of Autophagy: Nuclear Events Gain More Attention Mol Cell2017 Mar 2;65(5):781-785

[8] Pharmacological modulation of autophagy: therapeutic potential and persisting obstacles Nat Rev Drug Discov2017 Jul;16(7):487-511