微生物中的培养基的配制与灭菌的具体操作是怎样的？

培养基的配制与灭菌

1目的

11了解并掌握培养基的配制、分装方法

12掌握各种实验室灭菌方法及技术。

2原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

3材料

31器皿及材料

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。

32药品试剂

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。

4流程

称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。

5步骤

51培养基的制备

511称量药品

根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

512溶解

用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。

513调节pH

根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。

514溶化琼脂

固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

515过滤分装

先将过滤装置安装好（图3-1）。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。

516包扎标记

培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。

517灭菌

上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面(图3-2)，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。

518倒平板

将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板。

52灭菌方法

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。

521高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到105kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）。

5211操作方法和注意事项如下

加水

打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。

装料、加盖

灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。

排气

打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。

升压、保压和降压

当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。

灭菌后的培养基空白培养

灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。

522干热灭菌法

通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。

干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。

5221灭菌前的准备

玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。

5222干燥箱灭菌

将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。

用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。

5223火焰灭菌

直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。

6结果

61记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。

62试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。

7思考

71制备培养基的一般程序是什么？

72做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？

73灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？

4试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。

5高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？

1命中，暴击，急速

无论什么天赋什么职业，命中总是首先需要满足的，打boss(73级)需要命中 215是17%，达到这个肯定就100%了

如果小队(不是团队)有德国人的话，可以降低1%到203

如果团队有暗牧或者是一个点了强化精灵火并且在战斗中使用精灵火的鸟德的

可以降低到177

如果都有那当然是165 <- 这个是最低的了，也就是火法最低的门槛

在命中不达标时损失的dps是非常大的，一定要重视。

暴击是最配合火法天赋的属性，甚于法强

如果你们打的是速度战，那急速也是跟盗贼武器战叫板的属性，没有急速，法系DPS永远比不上近战的秒伤

持久战的话，急速还是不如暴击合适

2输出循环

一般情况下有冰法在团里的话火球术，出现效果就炎暴

如果在英勇/嗜血时或者是加速药水+古头时，保持炎暴在boss上面的dot效果，一直火球

如果没有冰法,请悲剧的保持灼烧效果

原理：在点了折磨天赋后，火球术的平射伤害已经略微高过炎暴术的平射

这就是为什么折磨火的法师在英勇/嗜血时会尽量用火球术，而不是用炎暴术，因为在英勇/嗜血时火球的时间已经接近16秒或者更低，而释放一个炎暴术也要消耗掉一个公共冷却时间，加上顺法法术和吟唱法术在衔接时的延迟，所以在英勇/嗜血时法师们仅仅让炎暴术的dot效果保持住，就一直使用火球术了

我记得以前有帖子说BLZ准备把活体最后炸的那一下的伤害翻倍。309的天赋模拟器显示等级3的活体DOT是1380伤害，炸的那一下是690伤害。现在游戏里活体的DOT还是1380伤害，最后一下是759伤害。因为我们一般会点火焰能量这个天赋，而DOT伤害不受火焰能量的影响

焚世烈焰目前不作用于炸弹DOT的暴击，应该是个BUG，不知道暴雪啥时候才能改。燃火是很垃圾，不过不点的话火法就没有一个CD技能了，啥爆发都没有了

无论嗜血/英勇有没有来到，饰品技能有没有开，炸弹总是要补的，它的伤害比瞬发炎爆还要高

3我们的假定条件是TBC环境，装备基本都是逼近毕业的，那么装备肯定是倾向于速度战型急速流，石头完全以急速为主，毫不客气的说，既然DOT无暴击收益，那么火法的暴击纯粹是靠脸丢盆，无奈的在于，嗜血/英勇必搓火球，那么就急速吧，起码能更好的把握仇恨

至于附魔，很常规，衣服要求6属性，手腕法强，武器阳炎，头部法强（关键在于你的武器是不是大洪流，这决定了你的石头有多少需要增值命中，包括头部铭文用暴击还是命中），腿部法强，手套也是一个选择点，命中是无奈的选择，够200就选暴击

4另外关注下饰品和辅助品的使用时机:

加速效果

在什么时候开的提升效果都是一样的，如果你早些开，可能还可以在斩杀阶段多开一次

增加法伤

在有英勇/嗜血时开，这个时机你增加的法伤相当于给你增幅了一样，你可以利用这些增加的法伤多打一下

遇到双开型的饰品，像古尔单之颅+盘蛇饰带我推荐在英勇/嗜血时开，这样盘蛇饰带的法伤增幅将达到最大

但是盘蛇饰带的劣势是使用时机很不好控制，把握不好还不如夸眼的效用实在。所以在饰品选择上请按照自己习惯选择，没有最好的饰品，只有最适合自己装备天赋和输出习惯的饰品

（1）依物理性质划分，该培养基无凝固剂琼脂，属于液体培养基，依用途划分，则属于选择培养基．

（2）该培养基中含有有机碳源，故培养的对象同化作用类型为异养型，由由于培养基中含有青霉素，其具有选择作用，故培养的可能是酵母菌或霉菌．

（3）该培养基中的碳源是（CH2O），没有生长因子．

（4）微生物的鉴定，常用固体培养基，故应向此培养基中加入凝固剂琼脂，由于大肠杆菌不能在含青霉素的培养基中生存，还应该除去青霉素．

（5）培养基常用高压蒸汽灭菌，目的是杀灭细菌和芽孢，防止杂菌污染，将接种环灼烧后冷却再接种的原因是灼烧是为了灭菌，冷却是防止杀灭要接种的菌．

（6）实验设计遵循单一变量原则和对照原则，其余无关变量应相同且适宜，要检验两种抗生素的杀菌作用，自变量为有无抗生素和抗生素的类型，他们之间形成相互对照，符合题意的只有C选项．

（7）A、依据题干信息可知，环丙沙星可促进DNA螺旋化，可抑制DNA分子复制，而利福平是抑制RNA聚合酶的活性，影响RNA的合成过程；故A正确．

B、红霉素能与核糖体结合，干扰mRNA与核糖体的结合，可以抑制翻译过程；故B错误．

C、结核杆菌的遗传物质是DNA，不存在RNA复制和逆转录过程；故C错误．

D、人体健康细胞中也同样不存在RNA复制和逆转录过程，只能发生①②③过程；故D错误．

故选：A．

故答案为：

（1）液体   选择      

（2）异养  酵母菌或霉菌

（3）（CH2O） 无       

（4）琼脂         青霉素   

（5）为了杀灭细菌和芽孢   灼烧是为了灭菌；冷却是防止杀灭要接种的菌  

（6）C

（7）A