DCFH-DA到底是哪一种

DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)是非标记性的氧化敏感的荧光探针，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光以判定细胞内活性氧的水平。

我买的是sigma的，满便宜的，大概300上下？记不清了。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。

DCFH-DA 的使用步骤：

DCFH-DA  使用仅提供指导和参考，具体实验方案应针对您的特定应用进行修改：

1 BCECF开封前，适当的做离心，以保证粉末落入样品管低,确保染料足量；

2 加入适量无水DMSO（DMSO检验用有机滤器进行过滤使用） 或者其他有机溶剂配制成 1～10mM储存液进行使用，剩余的制备液分装存储，避免重复冻融影响试剂活性；

3 正式开始实验前，采用生理盐缓冲液（常用的缓冲液有：PBS缓冲液，HBSSS缓冲液 和HEPESS缓冲液）稀释至工作浓度1～10μM之间，不同实验需根据需求调整至合适的工作浓度；

4  从培养基中取出细胞，向细胞中加入染料工作溶液，然后在室温或 37℃条件孵育细胞 5-60 分钟时长；

5  吸走染色用的工作液，然后用预热的缓冲液 或 细胞培养液进行清洗一遍。之后再加入预热的缓冲液或者细胞培养液，在适宜恒温条件下孵育。对于二乙酸酯的衍生物，需要短暂复原时间让细胞内酯酶将其水解，从而让染料对氧化应激产生反应。最佳的复原时间范围很广，由于某些细胞类型通常显示极其低水平的酯酶活性；

6 将细胞置于刺激物钱，需要先测定加载细胞的背景荧光强度；

7 评估阴性对照：

绿色发射光谱内检查未染色细胞的自荧光情况；

对于流式分析，查明染料加载和处理后细胞的前向角散射和侧向角散射是不变。细胞尺寸的变化可能与起泡或萎缩有关，由于处理或有毒反应引起的。

对包含和不包含刺激物的染料和缓冲液/培养基的无细胞混合物进行荧光检测。在不含细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，随着时间荧光的逐渐增加可能与瞬间水解、空气氧化、和/或光诱导氧化有关。

检查培养在生长培养液或简单缓冲液内的未处理加载细胞（对照）的荧光。在健康细胞内，细胞内酶和/或天然抗氧化剂会清除这些氧自由基。经过染料加载复原时间后，健康细胞应该表现出低水平的荧光信号，且在整个实验期间相对稳定。然而，逐渐增加（由于自氧化）或降低（由于细胞内染料丧失或光淬灭）也有可能观察到。在不含任何刺激物或诱导剂的体系内，健康和未处理细胞突然发现强荧光，表明细胞发生死亡或一些其他的氧化事件。

8 建立阳性对照，可采用下面方法刺激氧化活性：

肿瘤促进剂（PMA，工作浓度100pM～10μM）

H2O2 或者 TBHP（终浓度~100μM）（可以调节浓度：根据细胞对其的灵敏度以及反应性提高或降低浓度）。

9 需要确保其他化合物或者刺激试剂不造成起染料荧光淬灭。同时检查化合物的吸收光谱，确认化合物的吸收峰不会与氧化后的染料最大激发或者是发射光谱出现重读。