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成品拍最最物美价廉的非729莫属了！！！

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其次是银河，银河作为中低档产品的霸主，原创产品较少，其作品多为仿制欧洲名板，霸道减少，手感柔和，口碑较好。红双喜星级成品拍感觉一般，红双喜狂飙系列成品拍口碑较差，搭配不是太合理，性价比低。另外如蝴蝶，多尼克，等国际品牌也向中国市场推出了多种成品拍，可惜其质量无法与这些品牌的知名度相提并论。如果你坚持要买成品拍，可能729和银河是你仅有的选择。

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Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达

二、试剂准备

1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验

2、匀浆缓冲液：10M Tris-HCl(pH 68)1Oml；10%SDS 60ml；β-巯基乙醇 02ml；ddH2O 28ml

3、转膜缓冲液：甘氨酸 29g；Tris 58g；SDS 037g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml

4、001M PBS(pH74)：NaCl 80g；KCl 02g；Na2HPO4 144g；KH2PO4 024g；加ddH2O至1000ml

5、膜染色液：考马斯亮兰 02g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml包被液（5%脱脂奶粉,现配）：脱脂奶粉10g 溶于20ml的001M PBS中

6、显色液：DAB 60mg；001M PBS 100ml；硫酸镍胺 01ml；H202 10μl

三、操作步骤

（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆05-1min然后4℃,13,000g离心15min取上清液作为样品

（二）电泳：制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE

（三）转移：（半干式转移）

1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干接通电源,恒流1mA/cm2,转移15hr转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比

（四）免疫反应：

1、用001M PBS洗膜,5min ×3次

2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr

3、弃包被液,用001M PBS洗膜,5min×3次

4、加入一抗（按合适稀释比例用001M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部）,4℃ 放置12hr以上阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同

5、弃一抗和1%BSA,用001M PBS分别洗膜,5min×4次

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用001M PBS稀释）,平稳摇动,室温2hr

7、弃二抗,用001M PBS洗膜,5min×4次

8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应

四、注意事项

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件

2、显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2