急切求RT-PCR各种试剂的作用！！！

A液：变性液 裂解细胞或细菌等等，使所有DNA变性

B液：醋酸钠溶液 中和A液至中性，

C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1） 抽取RNA

D液：异丙醇

E液：75％乙醇 都是沉淀提取的RNA

F液：DEPC处理的灭菌去离子水 无RNA酶的水，防止RNA降解

G液：RNA酶抑制剂 防止RNA降解

H液：反转录反应液 使反转录酶具有最大活性的优化缓冲液

I液：反转录酶 使RNA翻转录成DNA

J液：PCR反应液 使Taq酶具有最大活性的优化缓冲液

K液：Taq DNA聚合酶(05u／µl) 扩增你所要的DNA片段

L液：矿物油 保持PCR反应管上层不会散热

M液：50倍TAE电泳缓冲液 电泳（鉴定扩增dna片段）所需的缓冲液。

N液：溴化乙锭溶液 嵌入DNA双链中的荧光分子，可在紫外灯下显桔红色。

0液：上样缓冲液 DNA电泳时所需的处理样品的缓冲液，兼有指示电泳进行状态的作用。

PCR全称多聚酶链式反应，原理是DNA的体外扩增。

具体来说：在EP管里加入DNA、合成原料（dNTP、引物）、耐热的DNA聚合酶（taq）后，放入PCR仪，PCR仪会利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。

用途：

1、核酸的基础研究：基因组克隆

2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序

3、反向PCR测定未知DNA区域

4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA

5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控

6、cDNA末端快速扩增技术

7、检测基因的表达

8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学

pcr中引物的作用是作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。

人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

扩展资料

引物设计的基本原则：

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。

-PCR

一、引物（上、下游）

PCR反应中的寡核廿酸引物至少应含有玲个与DNA模板序列完全互补的核酸长达20一24个核普酸，这样才能保证扩增反应的特异性。低温冷却液循环泵寡核昔酸引物在NCR反应中的浓度通常是。t一1OlumWL,这一浓度足以完成30个循环的扩增反应。浓度过高会引起模板与引物的错配，影响反应的待异性，同时使形成引物二聚体的概率增大，而且非特异产物和引物二聚体可与摸板竞争使用酶、引物和dNTP等，从而导致产量的下降。反之，若寡核普酸引物浓度过低，会导致PCR效率的降低。

二、DNA模板

DNA摸板亦称为靶序列。它既可以是单链DNA也可以是双链DNA,闭环DNA校板的扩增效率略低于线状DNA，因此用做模板时最好先将其线状化。DNA模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合醉抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质等。在一定范围内、PCR的产物随DNA模板浓度的升高而显著增加，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应的特异性，基因组DNA做模板时可用lmol左右，质位DNA做模板时用10ng左右。

三、缓冲液

BUFFER 作用主要是稳定PCR过程中的PH。用于PCR的标准级冲液的主要成分，其中二价镁离子的存在与否至关重要。镁离子浓度可直接关系DNA聚合敌的活性和DNA双链的解链温度，因此对反应的特异性及产证有显著影响。镁离子浓度过低会使DNA聚合酶活性降低、PCR产率下降;镁离子浓度过高则影响PCR反应的特异性。钱离子的最佳作用浓度为15一20~，肠由于镁离子可与缓冲液中的鳌合剂(如EDTA)以及带负电荷的丛团(如磷酸根)结合因此反应中游离的镁离子浓度取决于反应液中dN]P和EDTA的浓度。

四、DNA聚合酶

最早的PCR是采用大肠杆菌DNA聚合酶的Kl}片段催化退火的寡核昔酸引物在DNA模板上进行延仲反应。由于该酶会在DNA变性的拟度下失活所以在每一轮合成反应中都必须新加人一份酶。这种反应在扩增小片段DN州《200bp)时效果尚可，但对于扩增更长的目的DNA则结果不够理想。同时这种反应的产率通常较低，产物的大小也不均一。耐热DNA聚合酶的应用使这些问题迎刃而解。耐热DNA聚合酶在951C下持续温育仍能保持活性，因此寡核节酸引物的退火和延仲可以在更高的温度下进行，使引物与校板的误配大大减少，扩增反应的特异性和产率大大提高，而更长的扩增产物也得以生成。现已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性甲但其他性能有一定的差别。

五、Mg离子

Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的情况下 Mg的浓度在05-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度。Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

模板的用处就不说了吧

引物：引物首先会与模板配对，然后在酶的催化下从5‘到3’延长

dNTP：合成DNA当然得有原料，这原料就是4中碱基，dNTP就是4种碱基

Mg2+：增加特异性

酶及buffer：催化反应

PCR反应程序：变性，退火，延伸。一般来说，94度变性；退火温度依你的引物而定，延伸时间依你使用的酶及片段大小而定。以Extaq为例，按经验来看，退火温度初次设定在引物理论退火温度再低4度左右，延伸温度为72度，延伸时间按60s/kb来定。

当你扩不出来的时候，可以把退火温度按4度一个梯度进行pcr。

引物首先按加水量加水，再稀释10倍，在20ul的反应体系中，正向反向引物上样量一致，一般为02-04ul。模板如果用的cDNA，就加1ul，如果以质粒，则首先稀释50倍再加1ul。2mM母液的dNTP加2ul，ExBuffer加2ul，ExTaq加01ul，其余用ddH2O补齐至20ul。

引物没什么可说的,PCR是扩增“指定片段”的实验方法,“指定片段”如何指定自然就是靠上游和下游引物来前后固定扩增片段的位置Tween-20是用来中和的如果你的模板是自己从组织或者细胞里提的DNA,可能会混有少量影响PCR酶的化学物质（SDS、酚、乙醇什么的）,这时可加一点tween,或者triton X100,或者NP40什么的解决BSA是稳定酶用的一般都在酶切的时候加,PCR的时候不常用到