PCR体系中各成分的作用以及程序的设计_美容护肤

PCR主要组分包括：

双蒸水、引物、10X缓冲液、dNTP、模板和酶。

引物是与模板配对的十几二十个碱基，起始PCR的合成部位

10X缓冲液成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构

dNTP是四种脱氧核苷酸，A、T、C、G，PCR扩增中用于合成DNA的原料

模板是待扩增的DNA序列

酶能够催化DNA序列的合成

PCR程序主要包括：

预变性：95-98度5min，双链DNA解旋形成单链

变性：95-98度

20-30s，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

退火：55-60度，30s，系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸：72度，在酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端→5′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

循环变性至延伸步骤30-35次

最后72度5min

其中变性温度与时间跟选用的酶相关，退火温度跟引物设计有关，延伸时间跟你扩增片段长度和选用酶相关。

水性脱模剂是脱模剂内部成份能完全与水溶合，一般工业上都使用二甲基硅油等化合物的乳化液，而乳化液都是水溶性的，可以得到良好的的耐热性能，并且易清洗，防腐蚀、防火性好，对环境污染小，在运输途、仓储中比较安全。广泛应用于模具与橡胶、塑料等制品的脱模。

其主要配方组成成分是：石蜡5-20份，硬脂酸5-8份，植物油5-10份，助乳化剂5-8份，氢氧化钾计算量，其他辅料适量，尼泊金乙酯适量，去离子水至100份。将石蜡、硬脂酸、助乳化剂、辅助油性原料加一容器中加热至60-80℃熔化，将水、碱剂、辅助水性原料等放在另一容器中，混合均匀加热至80-90℃；使油相与水相温度基本保持一致，然后在剧烈搅拌下将水相慢慢加入到油相中，慢慢乳化、转相,搅拌速度随乳化温度降低而逐渐减慢，搅拌至室温后出产品，得白色水包油型乳剂。

　　建筑模板用防水胶配方

　　甲醛 3250Kg

　　尿素 ①650 Kg ②200 Kg ③400 Kg 聚乙烯醇 125 Kg 防水剂 400 Kg 水 325 Kg 操作工艺：

　　1、将甲醛计量入釜，加水325Kg，投入PVA，用氢氧化钠溶液调PH值=80，投入U1和防水剂，开汽升温55℃-65℃关汽。

　　2、自升温86℃-88℃计时保温，时间30分钟。投入U2保温30分钟，PH值自动降至=70-72

　　3、用氯化铵调PH值：70-65，65-60，60-54，反应时间60-90分钟，终点温度92℃±1℃，当粘度达20″-22″/92℃时加碱调PH值68，投入尿素400Kg，保温30分钟。

　　4、用氢氧化钠溶液调PH值=75-80，继续降温至40℃下出料。

PCR (聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。

1、引物

引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。　　引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

2、酶

目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量25U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3、dNTP

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到70～75，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

dNTP储存液：dNTP溶于pH为70的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20～200 μmol/L之间。4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。

dNTP使用浓度：在PCR反应中,使用低dNTP浓度,可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100μl的反应体系中,4种dNTP的浓度为20μmol/L,可基本满足合成26μg DNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP浓度(每种dNTP浓度为2μmol/L),能够高度灵敏地(1/107)扩增ras基因点突变的等位基因。

4、模板

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

5、Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为15～20mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

引物是PCR特异性反应的关键，不好的引物严重影响实验的质量，好的引物可以事倍功半;酶的选择一般是看实验的目的，例如克隆长片段，可能就需要高保真的聚合酶;dNTP浓度和Mg2+浓度高了会影响PCR反应特异性。DNA模板中还有蛋白质也会严总影响PCR质量，因此上述5个基本成分质量和浓度必须合理。

以下是根据讨论结果总结出来的模板类型，您可以根据自己的兴趣来选择编辑。应包含的部分：

节日简介（名称——包括别名、时间、流行区域）

节日由来（包括节日来源的传说）

节日习俗（包括习俗的变迁，即从传统习俗到当代习俗）