『DNA 分离胶 POP系列』

DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。

原理 ABI PRISM

310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至25h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。

由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

试剂与器材

1．BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA

polymerase FS，反应缓冲液等。

2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 02g/L，试剂盒配套试剂。

3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，32μmol/L，即32pmol/μl，试剂盒配套试剂。

4．DNA测序模板

可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为02g/L，即200ng/μl。

5．引物

需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成32μmol/L，即32pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

6．灭菌去离子水或三蒸水。

7．02ml或和05ml的PCR管 盖体分离，PE公司产品。

8．3mol/L 醋酸钠(pH52) 称取408g NaAc•3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至52，定容至100ml，高压灭菌后分装。

9．70%乙醇和无水乙醇。

10．NaAc/乙醇混合液 取375ml无水乙醇和25ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。

11．POP 6测序胶 ABI产品。

12．模板抑制试剂(TSR) ABI产品。

13．10×电泳缓冲液 ABI产品。

14．ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。

15．2400型或9600型PCR仪。

16．台式冷冻高速离心机。

17．台式高速离心机或袖珍离心机。

操作步骤

1．PCR测序反应

(1) 取02ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：

所加试剂 测定模板管 标准对照管

BigDye Mix 1μl 1μl

待测的质粒DNA 1μl －

pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1μl

待测DNA的正向引物 1μl －

M13(-21)引物 － 1μl

灭菌去离子水 2μl 2μl

总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10s，50℃

5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

2．醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到15ml EP管中。

(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。

(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。

3．电泳前测序PCR产物的处理。

(1) 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2) 将溶液转移至盖体分离的02ml PCR管中，稍离心。

(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。

4．上机操作

按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，12kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(12kV，20min)，在75kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为25h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

5．仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6．测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

计算

测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%

差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。

注意事项与评价

1．ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。

2．本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～45μl，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。

3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30～90ng，单链DNA需50～100ng，双链DNA需200～500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为16～20，最好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成32pmol/μl较好。

4．本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(985±05)

%，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。

具体的配置方法，你拿到产品说明书都有的，一般的实验室都有相关的配方。

导读：7月15日，商务时装品牌LILY的全新产品线 -- JOY系列与潮玩品牌POP MART跨界联名，通过二次艺术创作，破次元、跨圈层地将商务时装与之结合，打造“超级系列”以获得年轻职场新生代的精神共鸣

7月15日，商务时装品牌LILY的全新产品线 -- JOY系列与潮玩品牌POP MART跨界联名，通过二次艺术创作，破次元、跨圈层地将商务时装与之结合，打造“超级系列”以获得年轻职场新生代的精神共鸣，共同开启秋季“Z世代”年轻复古时髦的职场穿搭。

随着95后女性羣体开始步入职场，传统的职场服饰已无法满足“Z世代”人羣所认同的职场表达。她们年轻时髦、不愿设限，她们即内敛又时髦逗趣，紧跟时代又不被潮流吞没，可以说，“Z世代”正在重新定义时装、定义商务。

近年来，POP MART盲盒作为“Z世代”人羣的潮玩代名词，深受95后职场新女性的追捧。本次JOY系列与POP MART的深度联动，除了跨界选取萌趣形象化作JOY系列时尚语言、打造年轻复古感的穿搭，更有三款充满惊喜的联名盲盒TEE，力邀甜美职场女孩帮加入，助其获得更轻松愉悦的穿着乐趣和玩盒体验。

LILY X POP MART联名系列

跨界POP MART 喊话“Z世代”职场女性

“Z世代”女性，是在漫画、动画、游戏的伴随下成长起来的一代人。她们热衷二次元新文化潮流，追逐自由、不愿受限，“个性girl”成为了她们的代名词，即便是步入职场，穿什么衣服，画什么妆都需要能表达“我是谁”，传统的职场文化和二次元之间的割裂感必然需要弥补。

为此，作为商务时装的代表品牌，LILY适时将JOY系列与POP MART跨界碰撞，向新生代职场女性喊话：二次元精神与职场同在，打破传统才能创造更有趣味的职场穿搭。

为了让 “Z世代”的职场新女性体验到POP MART的玩盒惊喜感，此次联名款的盲盒Tee系列也被打造一个大大的“T恤版”盲盒。购买联名款盲盒Tee系列的消费者，将随机抽取到马戏团系列中PUCKY形象的三色印花T恤，其中包括：PUCKY独家绘制形象、小兔魔法师、波克小丑。7月15日开始，盲盒T恤将在天猫小黑盒开启剧透模式，作为马戏团系列盲盒T新品发布的重要阵地，天猫小黑盒资源位+小游戏加持将盲盒T的神秘感与开盒的仪式感发挥到了极致。而在正式开售阶段，该系列也在抖音和小红书平台开箱预热，线上种草;线下，消费者也可以在该系列入驻的线下WHOUS买手店与 POP-UP和马戏团的PUCKY零距离互动。

极具看点的POP MART独家超级系列究竟是怎样的继LILY与POP MART发布盲盒Tee超级系列后，今年秋天，马戏团系列将会继续#好戏上演#，秋季合作系列将经过二次创作的PUCKY形象，结合了刺绣手法、花型针织、大荷叶边、老花等复古时装元素，将年轻的复古感最大化演绎，编制出多彩欢乐的职场穿搭。

迸发如此多跨界灵感的JOY产品线，是LILY专为职场新生力量打造，全系列均以明快的色彩、活泼的复古花纹和，时髦的轮廓，构造出不受拘束的时尚穿搭，将“Z世代”初入职场的新鲜与快乐表现得淋漓尽致却又不失职场专业度。为配合“Z世代”的消费习惯，JOY系列只在线上发售，动动手指，时尚穿搭即时可得。

LILY X POP MART联名系列

打破圈层壁垒 打造职场新女性正合适的职场表达

随着中国消费市场升级，越来越多的女性消费者开始从满足物质需求转向更高的精神需求，除了功能、品质之外，颜值、文化、个性缺一不可，消费圈层经济已经日益成型，二次元、饭圈、新中产、母婴族、银发族、小镇青年族……每一个族羣都有着截然不同的消费需求，形成了一个个庞大成熟的圈层。如何突破圈层，寻找到品牌与圈层的情感共鸣，是当下众多品牌所思考的命题。

事实上，LILY早就敏锐感知到“圈层”的力量，并不断通过创意营销、IP跨界的方式，突破圈层壁垒，获取更多灵感：自2019年纽约时装周延续至今的首个“艺术家合作系列”，LILY X龙荻将“自由的精神、爱的品质”呈现在服装之上，突破对艺术圈层的感知;与中国国家地理联合推出的，以“人文地理”为主题的商务时装，又是对关注旅行、地理文化“东方文化”人士的一次靠近。而次JOY系列与POP MART的跨界联名合作，则打破了次元壁垒，为“Z世代”职场新女性带来更符合“个性”的职场表达，是对“二次元”圈层的突破。

除了跨界IP合作之外，LILY作为中国商务时装的代表品牌，在一贯致力于职业女性态度表达的同时，更关注女性羣体在时代下的状态变化，助力她们挖掘更多面的可能。2020年7月LILY四大产品线矩阵全面焕新，SHARP、FRESH、BASIC、JOY多产品线并行，以不同产品间的差异化定义、风格设计、IP合作等，聚焦不同年龄，不同职业层级，不同职业场景，不同女性角色的着装需求，打造“职场必备”穿搭。未来，LILY将会继续顺应圈层化发展趋势，用更高的品质，更有性价比的着装，实现与不同圈层的职场新女性的情感共鸣。

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由Megahouse出品的POPBBVer。是专门为海贼王女性角色打造的唯美手办系列。

真正意义上的手办指的是表现原型师个性的GARAGEKIT（简称GK），是指没有涂装的模型套件。但现在在中国大陆很多玩家都习惯了手办泛指到所有人形作品的叫法。

介绍

《航海王》是日本漫画家尾田荣一郎作画的少年漫画作品，于1997年7月22日在集英社《周刊少年Jump》开始连载。改编的电视动画《航海王》于1999年10月20日起在富士电视台首播。

2012年5月11日，《航海王》获得第41回日本漫画家协会赏。本作被吉尼斯世界纪录官方认证为“世界上发行量最高的单一作者创作的系列漫画”。