养细胞 2018-10-31

最近开始做实验了，还是要好好记录，好记性不如烂笔头～

以前没有养过细胞，唯一接触过的细胞是爪蟾卵母细胞，但它又不能传代，每次用每次从爪蟾肚子里取。注射完cRNA后，17度培养3天就用来做实验了。

每两天传代一次

C6/36, Aag2, NPC四天一传

扩毒的C6/36细胞通常培养六天

现在实验室会用到的细胞：血清10%

NPC 

SHSY  DMEM/F12培养基  

BHK  用于空斑实验 DMEM培养基  37度培养 通常1传5

C6/36  1640培养基 30度培养  不需要CO2

Aag2   SDrosophila培养基   30度培养 不需要CO2

RD    MEM培养基   37度培养

Vero    MEM培养基  其一 用PBS洗细胞三次以后，将胰酶加入培养瓶，10秒左右去掉胰酶，放入37℃培养箱消化，每隔10秒左右轻轻晃动培养瓶，直到观察到有流沙状细胞滑动。 其二 是用PBS洗细胞三次以后，将胰酶加入培养瓶，一分钟以后倒置，将有细胞的面朝上，然后轻轻拍打，使细胞脱落。这两个小tips都很适用的，因为相对于拍打和37℃消化而言，胰酶消化的时间过长，后者引起的细胞伤害更严重。当然除此之外，养Vero细胞和普通细胞一样：要注意无菌操作、不要看细胞太勤、注意轻拿轻放、传一瓶拿一瓶、让细胞尽可能多的享受自己最适的生活环境。做到这些，你的细胞养不好都难。

NPC  悬浮 接毒前NeurCult-XF培养基（05760）+Matrgel (1:100) 传到板子上，使其贴壁

            配培养基要加 rhEGF(到200ng/ml) rhFGF(到20ng/ml) Hepran (2mg/ml)

293T  生长快，通常倍增时间不到一天。每3~4 天1：10至1：20稀释，5% CO2条件下培养。细胞贴壁疏松，可只用EDTA消化，不要用胰蛋白酶过度消化。

 常用的培养基有哪些？

MEM （Minimum Essential Medium）: 也称最低必须培养基，它仅含有12种必须氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。可以广泛应用到各种细胞培养。

DMEM ：分为高糖和低糖，碳酸氢钠缓冲体系，所以需要CO2。

高糖的适合于高密度悬浮细胞培养，适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的细胞。 低糖的适合于生长速度较快，附着性较差的肿瘤细胞培养。

DMEM/F12 ：F12 培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较条件下哺乳动物细胞培养。

RPMI-1640 ：主要用于悬浮细胞培养，广泛用于哺乳物，特殊造血细胞，正常或者恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞。 另外K-562， L-60、urkat、IM-9 等淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞也可以使用。

McCoy’s 5A : 主要用于肉瘤细胞的培养， 还可以用于骨髓、皮肤、肺等原代培养，用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。比如HT29，BHL100等上皮细胞。

IMDM （Iscove’s Modified Dulbecco Medium）：主要用于红细胞和巨噬细胞前体培养。培养液中含有微量元素硒以及额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠以及HEPES。

M199 Medium 是具有确定化学成分的细胞培养液，主要用于鸡胚成纤维细胞培养，培养时必须辅助血清才能长期培养。

L-15(Leibovitz Medium)  适用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株，用于快速增值瘤细胞的培养。

Ham’s F-10 : 适用于小鼠细胞以及人的二倍体细胞的培养

Ham’s F-12 : 适用于单细胞培养或者克隆培养， 是无血清培养基中常用的基础培养基。

MCDB131 ： 适用于培养内皮细胞。

Opti-MEM I Reduced Serum Media : 适用于培养造血细胞。

用DMEM可以

DMEM培养基体外培养的巨噬细胞存活率和成层率高、吞噬能力强,与RPMI 1640相比,DMEM可作为一种简单而实用的体外分离培养巨噬细胞的培养基

但是培养基的具体成分,血清加入量等最好你询问一下细胞来源处,这样更利于细胞生长

不同的ES配方多少有些差异基础培养基一般用DMEM或DF12（以下为DMEM培养基为例）

1、提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻;

2、在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分(如，丙酮酸钠、抗生素等)，按照比例加入dmem培养基中，作好标签;放入4℃冰箱保存。

ES细胞培养方法：

化冻

将血清(Fetal Bovine Serum，Hyclone)从-20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜;也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存;

灭活

(1) 放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准);

(2) 当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟;若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短(比如：不超过5分钟)，则仍可使用;若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME

胞的培养;

(2) 取出，自然冷却至室温(约需1-3小时)，可分装或-20℃继续冻存;

分装

(1)转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀;吹出血清时要注意：不要吹出气泡(血清很粘稠，很容易产生气泡;如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下);标好批号和日期;

(2)放入-20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。

原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备

1取125-135dpc孕鼠，断颈处死;

2将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫)，剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中;

3 把平皿转入超净台;

4 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);

5 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次;

6 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);

7 加入适量Trypsin-EDTA(025% Gibco 25520，下同)，体积约等于组织块体积;

8 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘)，加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀(5-10次)，静置;

9 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。

10 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);

11 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签(ME-0;注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好)，转入培养箱培养;

12 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次)，若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代(视细胞疏密而定)，放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。

饲养层细胞(Feeder)的制备

注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem)

弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);

放入培养箱培养3小时(2-4小时);

用01% 明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可)，室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止;

弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性);

加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞)，半小时后即可使用(如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上)，可使用6-10天，用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做)。

ES细胞的复苏

提前制备好相应数量的Feeder;

准备37-39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管(冻存细胞)，迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化;

转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟;

弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中(冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿)，补加适量培养液;

转入培养箱培养，次日换液;此后每24小时换一次液，每48小时传一次代(视生长情况)。

ES细胞的换液

1 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内)；

2细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察(判断生长情况，并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;

3 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基(6 cm培养皿约5 mL，35 cm培养皿约3 mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基);

4 放回培养箱继续培养。

ES细胞的传代

前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;

提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内);

将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少;

将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去;再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打(视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来)，滴加补加培养基至5 ml左右(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为35cm培养皿，则补加至3ml左右)，作好标签;

前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。

ES细胞的冻存

常规方法将细胞消化成单细胞悬液;

转入试管，1000转/分钟离心5分钟;

配适量冻存液(为含10% 二甲亚砜(DMSO)，10% FBS的DMEM培养液);

弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液(只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可)，转入冻存管，作好标签;

放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。

经典的培养基有很多种，其中 DMEM、 RPMI 1640、 MEM 、 DMEM/F12 都是应用最广泛的培养基。其他 如 M199 、 IMDM 、 L15培养基等也用于某些细胞的培养。其具体的特征及应用如下：

基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年Eagle设计，BSS＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等。

又称低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年在Eagle's基础培养基（BME）上修改而来，删去赖氨酸、生物素，氨基酸浓度增加，适合多种细胞单层生长，有可高压灭菌品种，是一种最基本、试用范围最广的培养基，但因其营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。

DMEM是由Dulbecco改良的Eagle培养基，起初是为小鼠成纤维细胞设计的。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。

低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。高糖更适合高密度悬浮细胞培养，也适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。

Guilber 和Iscove将Dulbecco' Medium 改良为 Iscove's Medium，用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞，LPS刺激的B细胞，骨髓造血细胞，T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。

Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，含BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等。现也用于悬浮细胞培养，如哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。

1963年Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，特适于羊水细胞培养。

Ham's F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。由于营养成分丰富，且可以使用较少血清，故也常作为无血清培养基的基础培养基。

1950年Morgan等设计的具有确定化学成分的细胞培养液，即M-199。除BSS外，含有53种成分，为全面培养基，主要用于鸡胚成纤维细胞培养。此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。M-199可用于培养多种种属来源的细胞，并能培养转染的细胞。现广泛用于病毒学、疫苗生产。

1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，BSS＋40种成分。可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。

L-15培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养，用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株。此培养液采用磷酸盐缓冲体系，氨基酸组成进一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。

至于选择何种培养基并没有一定的标准，有几点建议可供参考：

(1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。也可以在一些生物公司的网站上搜索，如Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。

(2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。

(3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640 。

(4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

你是讲的细胞冻存时候的保存液吗

如果是的话,里面的基本成分,可以直接用培养细胞的培养基（通常为DMEM高糖培养基）+10%胎牛血清（FBS）+抗生素这个混合液再加10%的DMSO（二甲基亚砜）如果是非常娇贵的细胞可以直接用90%培养基+10%DMSO,冻存后细胞复苏效果更好

其作用：

DMSO：能够降低细胞冰点,减少冰晶的形成（因为冻存的时候形成的冰晶都很尖锐锋利,可能会刺穿细胞使其死亡）,减轻自由基对细胞损害

培养基：提供细胞一个基本的缓冲环境（算是对体内环境的模拟）

因为是做这个方向的,所以比较了解,如果有不清楚的欢迎追问~