近期，美国康奈尔大学 Samie R Jaffrey 研究组在 Cell 上发表了题为 “ A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating m6A-Modified mRNA ” 的研究，揭示了 YTHDF 蛋白调节 m6A 修饰的 mRNA 的功能统一模型。
与“不同的 m6A 位点结合不同的 DF 蛋白”的主流观点不同，该研究人员发现，所有 m6A 位点与三个 DF 蛋白都以基本相似的方式结合，它们以冗余的作用方式诱导同一子集的 mRNA 降解，没有证据表明它们能直接促进翻译。
图 1YTHDF 蛋白调控m6A 修饰的 mRNA 的功能模型
m6A (N6-methyladenosine)：是指腺嘌呤核苷 N6 位置发生了甲基化修饰。m6A 是真核 mRNA 最普遍的内部修饰，在功能上调节真核转录组，影响 mRNA 的剪接、输出、定位、翻译和稳定性。
m6A修饰有三类调节器：
Writer 甲基转移酶 (MTC)，负责催化，例如 METTL3、METTL14 和 WTAP；
Eraser 去甲基化酶 (Demethylase)，负责去除甲基化，例如 FTO 和 ALKBH5；
Reader 直接识别和结合 m6A 位点，使 m6A 修饰的 RNA 发挥特定的作用，主要包括 YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 等。
YTHDF ：一种 m6A“阅读器”，即 Reader。胞质中的 YTHDF 家族包括了 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 三种旁系同源物 (paralogs)，也可以简称为 DF1、DF2、DF3。据报道，三种 DF 有不同的功能，DF1 促进 mRNA 的翻译，DF2 促进 mRNA 的降解，DF3 促进翻译和降解。
关于 DF 旁系同源物选择性地结合不同的 m6A 位点的机制目前尚未清楚。此外，DF 蛋白功能差异的机制基础也仍不清楚，尤其是在它们同源性很高的情况下。
图 2 研究亮点
首先，研究人员观察 DF1 和 DF2 YTH 结构域与含有 m6A 的 RNA 的结合，发现在整个转录组中，DF 蛋白结合m6A 的氨基酸以及结合近端的氨基酸都是保守的，因此 三个 DF 蛋白与 m6A 结合的结构机制是相同的 。
DF 旁系同源物结合 m6A 序列基序 (Sequence motifs) 的差异反映可以其结合特性，研究发现 m6A 残基几乎只存在 DR-m6A-CH (D = A, G, U; R = A, G; H = A, C, U) 这一个高度保守的序列基序中，像GG-m6A-CU、AG-m6A-CU 都属于DR-m6A-CH 的亚基序 (Submotif) 。
为了确定每种 DF 的结合偏好，研究人员通过全转录组 iCLIP 图谱，检测了 HEK293T 细胞内源性表达的 DF1、DF2 和 DF3 的结合位点，分析发现三种 DF 结合位点序列亚基序的偏好相同。再结合已报道的 PAR-CLIP 数据，发现即使用不同的细胞系和不同的 CLIP 方法，DF 旁系同源物的 RNA 结合基本相同。因此， DF 旁系同源物的 m6A 结合模式相同 。
图 3 DF 蛋白与m6A结合位点的转录组分析
但是，不同的 DF 如何对m6A-mRNAs 发挥不同的分子效应这个问题仍未解决，研究人员又分析了 DF 旁系同源物之间的效应区域差异，以及它们的相互作用蛋白 (不同的 DF 蛋白可能通过与不同的蛋白相互作用介导其不同的功能)。结果显示， DF 旁系同源物的序列、功能域、相互作用蛋白和细胞内定位都高度相似 。
此外，研究人员还发现 DF 蛋白与降解有关的因子相互作用可信度较高，与翻译相关的因子相互作用可信度较低 。
根据已有报道，研究人员考虑到每种 DF 蛋白都有介导 m6A-mRNA 降解的可能性。于是，他们利用 siRNA 选择性敲降 HeLa 细胞中的 DF1、DF2 和 DF3，使用 RNA-seq 检测 mRNA 的丰度，证实是 DF2 影响了 m6A-mRNA 稳定性，而非 DF1 或 DF3。
图 4 DF 蛋白冗余地控制 m6A-mRNA 的丰度和稳定性
再对 DF 进行不同组合的双重敲降和三重敲降，并利用放线菌素 D (Actinomycin D) 抑制转录后 m6A-mRNA 的水平证明了： DF 蛋白的联合活性导致 m6A 修饰的 mRNA 降解，DF旁系同源物在功能上可以互相补偿，这种补偿功能也受其表达水平限制。当三种 DF 都耗竭时，补偿就不会发生，这时 m6A-mRNA 的稳定性得到最大程度的提高 。
接下来，研究人员检测了 DF 在 m6A-mRNA 的翻译调控中的作用。三种 DF 都与多聚核糖体组分无关，而富集于信使核糖核蛋白 (mRNP) 组分，该结果与 “DF 蛋白(任何一种) 稳定地结合至 mRNA 3'UTR，增强其翻译的模型” 不一致。
任何的 DF 旁系同源物基因沉默都不影响 HeLa 细胞中 mRNA 的翻译效率，即使是 DF 三重敲降也没有显著降低翻译效率。因此， 任何一种 DF 同源旁系物都不能直接增强 mRNA 的翻译，相反的，它们的主要作用是介导 m 6 A-mRNA 降解 。
图 5 DF 蛋白冗余地抑制白血病细胞的分化
已有报道 DF2 在急性髓系白血病 (AML) 中过表达，与 AML 的发生和发展有关，DF2 的缺失导致一些抑制 AML 相关基因转录本上调，例如在 DF2 敲除的白血病前期细胞中， TNFRSF1B 转录本的半衰期增加，表面 TNFR2 的表达量上升。
为探索 TNFRSF1B 的抑制是否是通过三种 DF 蛋白共同作用介导，研究人员对 MOLM-13 白血病细胞中的 DF 进行单独或联合敲降，发现 TNFRSF1B mRNA 表达水平受DF 的单独敲降影响较小，其中仅 DF2 的敲降使其略微升高，在三重敲降后却显著上调。因此，在 MOLM-13 细胞中 DF 蛋白共同作用控制 m6A-mRNA 的表达水平 。
小M 的思考
m6A 修饰已被证明与多种癌症的生长、转移和耐药性相关，小分子靶向m6A 修饰调节器是一种极具潜力的癌症治疗方法。
相关抑制剂 作用
SAH 氨基酸衍生物和几种代谢途径中的调节剂。METTL3-METTL14 异二聚体复合物 (METTL3-14) 的抑制剂
3-Deazaadenosine S-腺苷高半胱氨酸 (SAH) 水解酶抑制剂；通过抑制 SAH 水解来抑制 m6A 基团插入 mRNA 底物中
IOX1 甲基转移酶 ALKBH5 抑制剂
FB23-2 有效、选择性的 mRNA m6A去甲基酶 FTO 抑制剂
FG-2216/IOX3 HIF-PHD 抑制剂；在体外对 FTO 有抑制作用
Rhein 可逆地与 FTO 催化结构域结合，并竞争性地阻止了对 m6A 修饰底物的识别
Entacapone 特异的外周活性的邻苯二酚-O-甲基转移酶 (COMT) 抑制剂；竞争性 FTO 抑制剂
Meclofenamic acid 非甾体类抗炎化合物；FTO 抑制剂
缩写：
MTC:Methyltransferase complex
YTHDF: YT521-B homology domain-containing family/YTH domain family
原文阅读 ： Sara Zaccara, et al A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating M 6A-Modified mRNA Cell 2020 Jun 25;181(7):1582-1595e18
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