western blot 的原理及操作步骤、应用有哪些?

原理

Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

操作步骤

（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆05-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

（三）转移：（半干式转移）

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移15hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

（四）免疫反应：

1、用001M PBS洗膜，5min ×3次。

2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3、弃包被液，用001M PBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗（按合适稀释比例用001M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5、弃一抗和1%BSA，用001M PBS分别洗膜，5min×4次。

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用001M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。

7、弃二抗，用001M PBS洗膜，5min×4次。

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

四、注意事项

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。

3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上b，然后利用抗体进行检测。对已v知表达蛋白，可用相应抗体作为6一s抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分7的抗体检测。一p、原理 与mSouthern或Northern杂交方3法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二n抗。经过PAGE分0离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上s，固相载体以1非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分1离的多肽类型及y其生物学活性不w变。以3固相载体上y的蛋白质或多肽作为4抗原，与x对应的抗体起免疫反5应，再与d酶或同位素标记的第二p抗体起反3应，经过底物显色或放射自显影以4检测电泳分1离的特异性目的基因表达的蛋白成分4。该技术也t广p泛应用于u检测蛋白水4平的表达。二c、试剂准备 8、SDS-PAGE试剂:见6电泳实验。 3、匀0浆缓冲液：0。0M Tris-HCl(pH 2。3)6。Oml；80%SDS 0。0ml；β-巯基乙i醇 0。7ml；ddH3O 0。8ml。 3、转膜缓冲液：甘氨酸 2。1g；Tris 3。2g；SDS 0。36g；甲醇700ml；加ddH8O定容至6000ml。 0、0。03M PBS(pH0。1)：NaCl 3。0g；KCl 0。8g；Na1HPO1 8。32g；KH1PO1 0。81g；加ddH1O至7000ml。 6、膜染色液：考马e斯亮兰 0。0g；甲醇70ml；乙d酸4ml；ddH4O418 ml。包被液（7%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1。0g 溶于j80ml的0。00M PBS中3。 6、显色液：DAB 0。0mg；0。08M PBS 10。0ml；硫酸镍胺 0。6ml；H003 7。0μl。三o、操作步骤（一z）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上i样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀0浆缓冲液，机械或超声波室温匀4浆0。5-5min。然后8℃，63,000g离心564min。取上e清液作为5样品。（二e）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。（三v）转移：（半干w式转移） 6、电泳结束后将胶条割至合适大y小z，用转膜缓冲液平衡，5min×6次。 4、膜处理：预先裁好与s胶条同样大b小e的滤纸和NC膜，浸入t转膜缓冲液中530min。 5、转膜：转膜装置从4下n至上w依次按阳极碳板、03层滤纸、NC膜、凝胶、73层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一o步去除气3泡，上v压600g重物，将碳板上b多余的液体吸干f。接通电源,恒流6mA。cm6，转移6。5hr。转移结束后，断开k电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入a膜染色液中670s后，在70%甲醇中6多次脱色，至背景清晰，然后用双0蒸水7洗，风3干x夹于j两层滤纸中3保存，留与w显色结果作对比4。（四）免疫反2应： 1、用0。01M PBS洗膜，6min ×7次。 5、加入e包被液，平稳摇动，室温0hr。 6、弃包被液，用0。02M PBS洗膜，6min×0次。 6、加入r一z抗（按合适稀释比5例用0。05M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），3℃ 放置70hr以5上l。阴性对照，以01%BSA取代一y抗，其余步骤与r实验组相同。 6、弃一s抗和6%BSA，用0。05M PBS分2别洗膜，2min×5次。 0、加入j辣根过氧化1物酶偶联的二e抗（按合适稀释比3例用0。08M PBS稀释），平稳摇动，室温7hr。 6、弃二w抗，用0。07M PBS洗膜，5min×2次。 2、加入y显色液，避光显色至出现条带时放入x双5蒸水7中0终止3反1应。四、注意事项 4、一u抗、二o抗的稀释度、作用时间和温度对不d同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。 1、显色液必须新鲜配置使用，最后加入tH3O5。 1、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小z心7仔细。2011-10-28 12:19:53

blotherm是碧欧泉品牌

碧欧泉，保养品品牌，起源于1950年代，隶属法国莱雅集团。产品主要针对年轻20至35岁年轻女性，涉及面部护肤，彩妆和身体护理。其碧欧泉男士护肤为全球销量最大，产品线最齐的男士护理品牌。

碧欧泉的产品均含有独特的矿泉活细胞因子Life Plankton™活源精粹，根据不同系列产品具体功效，针对性加入自然活性成分，两者相辅相成，对肌肤倍加呵护。

扩展资料：

品牌发展历程：

1、1935年，一位温泉皮肤科医师Jullien发现，这种温泉水中含有矿泉活性因子。

2、1952年，一名叫Jeannine Marissal的年轻女士首次将这种矿泉活性因子加入护肤面霜，碧欧泉品牌就此诞生，碧欧泉首款防护水润手霜Bio-Mains也诞生了。

3、1985年，碧欧泉男士诞生，打破了男士护肤禁忌，为男性护肤度身定制了护肤方案。

4、2001年，碧欧泉来到中国，2006年，碧欧泉实验室与斯坦福大学共同发现Life Plankton™活源精粹在肌肤新生和抵御外界侵害方面的出色能力。

-碧欧泉

什么是Westernblot

最佳答案

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、试剂准备

1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。

2、匀浆缓冲液：10M Tris-HCl(pH 68)1Oml；10%SDS 60ml；β-巯基乙醇 02ml；ddH2O 28ml。

3、转膜缓冲液：甘氨酸 29g；Tris 58g；SDS 037g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、001M PBS(pH74)：NaCl 80g；KCl 02g；Na2HPO4 144g；KH2PO4 024g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考马斯亮兰 02g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉10g 溶于20ml的001M PBS中。

6、显色液：DAB 60mg；001M PBS 100ml；硫酸镍胺 01ml；H202 10μl。

三、操作步骤

（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆05-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

（三）转移：（半干式转移）

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移15hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

（四）免疫反应：

1、用001M PBS洗膜，5min ×3次。

2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3、弃包被液，用001M PBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗（按合适稀释比例用001M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5、弃一抗和1%BSA，用001M PBS分别洗膜，5min×4次。

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用001M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。

7、弃二抗，用001M PBS洗膜，5min×4次。

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

四、注意事项

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。

3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细

western

blot

是蛋白印迹，一种用于通过特异的抗原抗体反应检测蛋白的表达量的实验方法；简言之，是蛋白和蛋白之间的杂交；你说的protein

blot

哪里有提到的，文献中一般都说westernblot，

我猜可能是指western

，你可以看看有没用到一抗、二抗，

我只会做

要不传影象给你

溶液:

(1) 转移缓冲液：称取29g甘氨酸，58g Tris碱，037 SDS，200ml甲醇，加去离子水至1000ml，如果蛋白分子量小可不加SDS。

(2) PBS－T： NaCl 80g, KCl 02g, KH2PO4 02g, Na2HPO4•12H2O 29g, 溶于800ml去离子水中，用盐酸调PH值为74，定溶至1000ml，加005％Tween20。

(3) 封闭液：5%脱脂奶溶于PBS中

(4) 氨基黑染液：02%氨基黑溶于7%乙酸中。

(5) 氨基黑脱色液：30%甲醇, 10%冰醋酸溶液

SDS-PAGE相关溶液

(1)电极缓冲液：

Tris: 6g

甘氨酸： 288g

(10% )SDS: 10ml

加1000 ml H2O PH:83

(2)分离胶buffer: 100ml:

Tris:366g

1N HCL:(约48ml): PH:89

加水至：100ml

(3) 浓缩胶buffer: 100ml:

Tris: 598g

1N HCL:(约48ml): PH:

加水至：100ml

(4)凝胶贮存液： 100ml:

Acr:30g

Bis:08g

加水至：100ml

(5) 4Xloading buffer:

2-Me: 20% 2ml

SDS: 8% 08g

Glycerin: 40% 4ml

Bromophenol Blue: 04% 004g

Tris-CL (ph68) 240mM 25ml(浓缩胶buffer)

加15ml H2O

total: 10ml

(6) 染色液(快速染色配方，染色1小时

01% Coomassie blue, 10% acetic acid, 45% methanol

考马斯蓝R-250 1g

甲醇 450ml

水 450ml

冰醋酸 100ml

(7) 脱色液：1000ml

冰醋酸： 75ml

甲醇： 50ml

水： 875ml

细胞裂解液

（1）Buffer A: 25 mM Tris pH 7,5

50 mM KCl

2 mM MgCl2

1 mM EDTA

5 mM dithiothreitol (DTT)

（2）细胞核裂解液

Buffer NE:

25 mM Tris pH 7,5

042 M NaCl

15 mM MgCl2

05 mM EDTA

1 mM dithiothreitol (DTT)

25% Sucrose

02% SDS (免疫沉淀不加)

裂解细胞前加入蛋白酶抑制剂至终浓度为 100 mg•L-1 PMSF, 1 mg•L-1 Aprotinin, 2 mg•L-1 Leupeptin

步骤:SDS-PAGE电泳

按照胶配置方法配制不同浓度PAGE胶，电泳置染料抵达分离胶底部，断开电源。 取下凝胶，

Western Blot

1 电泳结束后，切下带有要转移蛋白泳道的凝胶用，右下角作一标记以确定方向及正反面。

2 剪1块与凝胶大小相同的NC膜（不能大于凝胶），右下角作一标记，浸泡于转移缓冲液中，大约5分钟。

3 剪8块新华1号滤纸，右下角作一标记，其大小略与凝胶相同（不能大于凝胶）。

4 将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡，按阳极到阴极（从下至上）顺序安装转移装置: 平放底部电极，在底部电极上放置4张浸泡好的滤纸,精确对齐，将NC膜放在滤纸上，排除气泡。把SDS-PAGE 电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗，平放于NC膜上，用玻棒挤出所有气泡。在其上再放置4张浸泡好的滤纸，排出气泡。

5 将上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶面积按1mA/cm2接通电源，电转移2~4h。100mA,2h。

6 转移结束后，去除滤纸。把凝胶转移到考马斯亮蓝染液的托盘中染色，以检查蛋白转移是否完全。剪下含分子量标准的NC膜放在氨基黑染液中染色30秒，氨基黑脱色液脱色。

7 将转移上蛋白的NC膜以蒸馏水略洗稍干后，浸在封闭液中4℃封闭过夜，然后用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。

8 将膜与第一抗体室温孵育2h，第一抗体用PBS-T缓冲液按不同稀释度稀释以摸索最合适的一抗浓度，然后PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。

9 将膜与HRP标记的羊抗鼠IgG(1:5000)共同孵育1h，PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。

10 配制发光底物（按1：1混合底物液）。

11 PBS-T缓冲液洗涤后在化学发光底物显色2分钟，凝胶成像系统观察照相。（或DAB显色液中避光显色~15分钟，出现条带后立即以水冲洗以中断显色反应）。

我只是举个例子给你看,因为只有你自己想出来的实验才是得心应手的别人手把手教你做实验,那么你的思路就会跟着别人走,有可能被别人误导,那你做这个实验又有什么意思