这个算是复杂混合物剖析,需要相关专业人士去做。
首先要有一个清析的分析思路,可以通过蒸馏的方法分离低沸点及高沸点物质,通过馏出气相温度可以大概判断低沸组成,如果100度以下有大量馏分,可能是一些低沸溶剂之类,100度左右有大量馏分一般可以认为是水。可以对样品做一个GC-MS,可以对样品中300度内能气化的成分进行分析,通过GC来定量,通过MS去对样品中各组分定性。关于水的精确定量可以采用卡尔费休法。
样品常压蒸馏后如果有残留,首先要判断残留物是无机的还是有机的,最简单的方法,将蒸干后的样品灼烧,如果质量没有损失,可以认为是无机物,通过XRD对样品中无机物进行定性分析,通过XRF对样品各元素进行定量分析,结合XRF与XRD的数据可以得出各无机成分的组成及含量。
如果灼烧样品部分损失或全部损失,可以认为含有有机物,如果是灼烧完全失重,则可以认为全部是有机物,可以通过薄层色谱大概地区分含有几种成分,当然需要样品有紫外吸收,此时可以用HPLC-MS去对样品进行定性定量分析,这类未知物HPLC条件需要去摸索,相对比较烦。当然也可以通过层析的方法分离富集各组成成分,然后通过FTIR或NMR对样品进行表征。如果样品蒸干后是有机和无机的混合物,则需要用合适的溶剂将有机组分和无机组分分离之后按上面的思路去做。
所有工作都做完最关健就是数据的处理,需要相关专业人员对图谱数据分析计算,
1形态和培养特征观察
采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20~24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导
2生长条件试验
(1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0 85 、1 20 和1 71) (mol/ L) ;
(2)耐酸碱试验(p H :4 3 、5 7 、6 8 、8 4 、8 6 和8 7) ;
(3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃) 。
分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。
3生理生化试验
⑴过氧化氢酶测定
将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%-—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。
⑵葡萄糖产酸产气实验
在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,16g/100mL的溴甲酚紫14mL作指示剂, 在培养基内放置一小倒管,分装试管置37℃培养24h, 经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。
⑶淀粉水解实验
接种新鲜的菌种于含有05g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。
⑷明胶液化实验
将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应
⑸甲基红(MR)试验
接种实验细菌于PYG培养基,于37℃培养2天后,于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液,如呈红色,表示阳性。
⑹乙酰甲基甲醇V-P实验
接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37℃培养2天后,取培养液1mL在其中
加入1ml 10%的NaOH,混匀,再加入3-4滴2%氯化铁溶液。数小时后,培养基表面的下层出现红色者,为阳性
⑺柠檬酸盐
取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上,适温培养3-7天,培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应,不变者则为阴性
⑻酪素水解试验
牛奶平板的制备:取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中(或用50mL脱脂牛奶),另称15g琼脂溶于50mL蒸馏水中,将两液分开灭菌。待冷至45-50℃时,将两液混匀倒平板,即成牛奶平板。将平板倒置过夜,使表面水分干燥,然后将菌种点接在平板上,每皿可点接3-5株菌。适温培养1、3、5天,记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时,切勿将牛奶和琼脂混合灭菌,以防牛奶凝固
⑼厌氧生长测定
将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性
(10)厌氧硝酸盐产气
接种封油:以斜面菌种用接种环接种后,用凡士林油(凡士林和液体石蜡为1:1)封管,封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。
观察结果:培养2-7d,观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生,表示反硝化作用产生氮气,为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡,则只能按可疑或阴性处理。
(11)石蕊牛奶的反应
牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况
(12)糖发酵实验
将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中,按表分装含5mL培养基的试管分别取02mL,被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃培养24h,振荡培养。检测时取培养液少许置于比色盘内,同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照,滴加试剂比较颜色的变化,记录产酸的强弱
附一些培养基:
①PY培养基(100mL):蛋白胨10g,酵母提取物10g,无机盐溶液40mL[盐溶液成分:无水CaCl2 02g,MgSO4 200g ,K2HPO4 10g, ,KH2PO4 10g,NaHCO3 100g,NaCl 20g](将CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸馏水中,再加500mL蒸馏水,一边搅拌一边缓慢加入其他盐类继续搅拌直到全部溶解,加蒸馏水定容至1000mL,混合后贮备于4℃)
②PYG培养基:PY在基础培养液内加入10g葡萄糖
③营养明胶 蛋白胨5g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL、pH68~70;加热溶解、校正至pH74~76,分装小管,121℃高压灭菌10min,取出后迅速冷却,使其凝固。复查最终pH应为68~70
④柠檬酸盐斜面培养基:柠檬酸钠 3g NH4H2PO4 1g MgSO4 02g
K2HPO4 1g NaCl 5g 琼脂15—20g 水1000mL 加热溶解后,调pH至7,再加入16%溴麝香草酚蓝指示剂10mL,培养基呈绿色,分装试管,每管5mL,121灭菌30min
⑤含硝酸钾的营养肉汤 加入2g硝酸钾入营养肉汤
416S rDNA 序列分析
这个LZ另外查好了,很多学问。
5生长曲线
活菌计数方法:采用涂布法,进行菌落计数,每隔一段时间(2-4小时)测
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